Os metabolitos inmunomoduladores son unha característica clave do microambiente tumoral (TME), pero con algunhas excepcións, as súas identidades seguen sendo en gran parte descoñecidas. Aquí, analizamos tumores e células T dos tumores e ascite de pacientes con carcinoma seroso de alto grao (HGSC) para revelar o metaboloma destes diferentes compartimentos do TME. A ascite e as células tumorais presentan amplas diferenzas nos metabolitos. En comparación coa ascite, as células T que se infiltran no tumor están significativamente enriquecidas en 1-metilnicotinamida (MNA). Aínda que o nivel de MNA nas células T é elevado, a expresión da nicotinamida N-metiltransferase (un encima que cataliza a transferencia de grupos metilo da S-adenosilmetionina á nicotinamida) limítase aos fibroblastos e ás células tumorais. Funcionalmente, o MNA induce as células T a segregar a citocina promotora de tumores factor de necrose tumoral alfa. Polo tanto, o MNA derivado do TME contribúe á regulación inmunitaria das células T e representa un posible obxectivo de inmunoterapia para o tratamento do cancro humano.
Os metabolitos derivados de tumores poden ter un profundo efecto inhibitorio sobre a inmunidade antitumoral, e cada vez hai máis evidencias que demostran que tamén poden servir como unha forza impulsora clave para a progresión da enfermidade (1). Ademais do efecto Warburg, traballos recentes comezaron a caracterizar o estado metabólico das células tumorais e a súa relación co estado inmunitario do microambiente tumoral (TME). Estudos en modelos de rato e células T humanas demostraron que o metabolismo da glutamina (2), o metabolismo oxidativo (3) e o metabolismo da glicosa (4) poden actuar de forma independente en varios subgrupos de células inmunitarias. Varios metabolitos nestas vías inhiben a función antitumoral das células T. Demostrouse que o bloqueo da coenzima tetrahidrobiopterina (BH4) pode danar a proliferación das células T, e o aumento de BH4 no corpo pode mellorar a resposta inmunitaria antitumoral mediada por CD4 e CD8. Ademais, o efecto inmunosupresor da quinurenina pode ser rescatado pola administración de BH4 (5). No glioblastoma mutante da isocitrato deshidroxenase (IDH), a secreción de (R)-2-hidroxiglutarato (R-2-HG) enantiometabólico inhibe a activación, proliferación e actividade citólise das células T (6). Recentemente, demostrouse que o metilglioxal, un subproduto da glicólise, é producido por células supresoras de orixe mieloide, e a transferencia de metilglioxal ás células T pode inhibir a función das células T efectoras. No tratamento, a neutralización do metilglioxal pode superar a actividade das células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) e mellorar sinerxicamente a terapia de bloqueo de puntos de control en modelos murinos (7). Estes estudos enfatizan conxuntamente o papel clave dos metabolitos derivados do TME na regulación da función e a actividade das células T.
A disfunción das células T foi amplamente reportada no cancro de ovario (8). Isto débese en parte ás características metabólicas inherentes á hipoxia e á vasculatura tumoral anormal (9), que resultan na conversión de glicosa e triptófano en subprodutos como o ácido láctico e a quinurenina. O exceso de lactato extracelular reduce a produción de interferón-γ (IFN-γ) e impulsa a diferenciación de subgrupos mielosupresores (10, 11). O consumo de triptófano inhibe directamente a proliferación das células T e inhibe a sinalización do receptor das células T (12-14). A pesar destas observacións, realizouse unha gran cantidade de traballos arredor do metabolismo inmunitario en cultivos de células T in vitro utilizando medios optimizados ou limitándose a modelos de rato homólogos in vivo, ningún dos cales reflicte plenamente a heteroxeneidade dos cancros humanos e o macro e microambiente fisiolóxico.
Unha característica común do cancro de ovario é a propagación peritoneal e a aparición de ascite. A acumulación de líquido celular na ascite está asociada a unha enfermidade avanzada e a un mal prognóstico (15). Segundo os informes, este compartimento único é hipóxico, ten altos niveis de factor de crecemento endotelial vascular (VEGF) e indoleamina 2,3-dioxixenase (IDO) e está infiltrado por células T reguladoras e células inhibitorias mieloides (15-18). O ambiente metabólico da ascite pode ser diferente do do propio tumor, polo que a reprogramación das células T no espazo peritoneal non está clara. Ademais, as diferenzas clave e a heteroxeneidade entre a ascite e os metabolitos presentes no ambiente tumoral poden dificultar a infiltración de células inmunitarias e a súa función nos tumores, e é necesaria máis investigación.
Para resolver estes problemas, deseñamos un método sensible de separación celular e espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS/MS) para estudar diferentes tipos de células (incluíndo células T CD4+ e CD8+), así como dentro e entre tumores. Os seus metabolitos abarcan células no mesmo ambiente de ascite e tumor do paciente. Usamos este método xunto coa citometría de fluxo de alta dimensional e a secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) para proporcionar un retrato altamente resolto do estado metabólico destas poboacións clave. Este método revelou un aumento significativo no nivel de 1-metilnicotinamida (MNA) nas células T tumorais, e os experimentos in vitro mostraron que o efecto inmunomodulador do MNA sobre a función das células T era descoñecido previamente. En xeral, este método revela as interaccións metabólicas mutuas entre tumores e células inmunitarias e proporciona información única sobre os metabolitos da regulación inmunitaria, o que pode ser útil para o tratamento da inmunoterapia do cancro de ovario baseada en células T. Oportunidades de tratamento.
Empregamos citometría de fluxo de alta dimensional para cuantificar simultaneamente a captación de glicosa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucosa (2-NBDG) e a actividade mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) son marcadores típicos que distinguen as células inmunitarias e as poboacións de células tumorais (Táboa S2 e Figura S1A). Esta análise mostrou que, en comparación coas células T, as ascites e as células tumorais teñen niveis máis altos de captación de glicosa, pero presentan diferenzas menores na actividade mitocondrial. A captación media de glicosa das células tumorais [CD45-EpCAM (EpCAM)+] é de tres a catro veces maior que a das células T, e a captación media de glicosa das células T CD4+ é 1,2 veces maior que a das células T CD8+, o que indica que os linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) teñen diferentes requisitos metabólicos mesmo no mesmo TME (Figura 1A). En contraste, a actividade mitocondrial nas células tumorais é similar á das células T CD4+, e a actividade mitocondrial de ambos os tipos de células é maior que a das células T CD8+ (Figura 1B). En xeral, estes resultados revelan o nivel metabólico. A actividade metabólica das células tumorais é maior que a das células T CD4+, e a actividade metabólica das células T CD4+ é maior que a das células T CD8+. A pesar destes efectos en todos os tipos de células, non hai unha diferenza consistente no estado metabólico das células T CD4+ e CD8+ ou nas súas proporcións relativas na ascite en comparación cos tumores (Figura 1C). En contraste, na fracción de células CD45, a proporción de células EpCAM+ no tumor aumentou en comparación coa ascite (Figura 1D). Tamén observamos unha clara diferenza metabólica entre os compoñentes das células EpCAM+ e EpCAM-. As células EpCAM+ (tumorais) teñen unha maior captación de glicosa e actividade mitocondrial que as células EpCAM-, o que é moito maior que a actividade metabólica dos fibroblastos nas células tumorais no TME (Figura 1, E e F).
(A e B) Intensidade media de fluorescencia (MFI) da captación de glicosa (2-NBDG) (A) e actividade mitocondrial das células T CD4+ (MitoTracker vermello escuro) (B) Gráficos representativos (esquerda) e datos tabulados (dereita), células T CD8+ e células tumorais EpCAM+ CD45 de ascite e tumor. (C) A proporción de células CD4+ e CD8+ (de células T CD3+) en ascite e tumor. (D) Proporción de células tumorais EpCAM+ en ascite e tumor (CD45−). (E e F) Captación de glicosa EpCAM+ CD45-tumor e EpCAM-CD45-matriz (2-NBDG) (E) e actividade mitocondrial (MitoTracker vermello escuro) (F) Gráficos representativos (esquerda) e datos tabulados (dereita) Ascite e células tumorais. (G) Gráficos representativos da expresión de CD25, CD137 e PD1 por citometría de fluxo. (H e I) Expresión de CD25, CD137 e PD1 en linfocitos T CD4+ (H) e linfocitos T CD8+ (I). (J e K) Fenotipos inxenuos, de memoria central (Tcm), efectores (Teff) e de memoria efectora (Tem) baseados na expresión de CCR7 e CD45RO. Imaxes representativas (esquerda) e datos tabulares (dereita) de linfocitos T CD4+ (J) e linfocitos T CD8+ (K) en ascite e tumores. Valores de P determinados pola proba t emparellada (*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). A liña representa os pacientes emparellados (n = 6). FMO, fluorescencia menos un; MFI, intensidade media de fluorescencia.
Unha análise posterior revelou outras diferenzas significativas entre o estado fenotípico das células T altamente resoltas. A activación (Figura 1, G a I) e a memoria efectora (Figura 1, J e K) nos tumores son moito máis frecuentes que na ascite (proporción de células T CD3+). Do mesmo xeito, a análise do fenotipo mediante a expresión de marcadores de activación (CD25 e CD137) e marcadores de esgotamento [proteína de morte celular programada 1 (PD1)] mostrou que, aínda que as características metabólicas destas poboacións son diferentes (Figura S1, B a E), non se observaron diferenzas metabólicas significativas de forma consistente entre os subconxuntos inxenuos, efectores ou de memoria (Figura S1, F a I). ​​Estes resultados confirmáronse mediante o uso de métodos de aprendizaxe automática para asignar automaticamente fenotipos celulares (21), o que revelou ademais a presenza dun gran número de células da medula ósea (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) na ascite do paciente (Figura S2A). Entre todos os tipos de células identificados, esta poboación de células mieloides mostrou a maior captación de glicosa e actividade mitocondrial (Figura S2, B a G). Estes resultados destacan as fortes diferenzas metabólicas entre os múltiples tipos de células que se atopan na ascite e nos tumores en pacientes con HGSC.
O principal desafío para comprender as características metabonómicas do TIL é a necesidade de illar mostras de células T de pureza, calidade e cantidade suficientes dos tumores. Estudos recentes demostraron que os métodos de clasificación e enriquecemento de esferas baseados na citometría de fluxo poden levar a cambios nos perfís de metabolitos celulares (22-24). Para superar este problema, optimizamos o método de enriquecemento de esferas para illar o TIL do cancro de ovario humano resecado cirurxicamente antes da análise por LC-MS/MS (véxase Materiais e métodos; Figura 2A). Para avaliar o impacto global deste protocolo nos cambios nos metabolitos, comparamos os perfís de metabolitos das células T activadas por doantes sans despois do paso de separación de esferas anterior con células que non foron separadas con esferas senón que permaneceron en xeo. Esta análise de control de calidade descubriu que existe unha alta correlación entre estas dúas condicións (r = 0,77) e que a repetibilidade técnica do grupo de 86 metabolitos ten unha alta repetibilidade (Figura 2B). Polo tanto, estes métodos poden realizar análises precisas de metabolitos en células sometidas a enriquecemento de tipo celular, proporcionando así a primeira plataforma de alta resolución para identificar metabolitos específicos en HGSC, permitindo así que as persoas obteñan unha comprensión máis profunda da especificidade celular do programa de metabolismo sexual.
(A) Diagrama esquemático do enriquecemento con esferas magnéticas. Antes da análise mediante LC-MS/MS, as células someteranse a tres roldas consecutivas de enriquecemento con esferas magnéticas ou permanecerán no xeo. (B) O efecto do tipo de enriquecemento na abundancia de metabolitos. A media de tres medicións para cada tipo de enriquecemento ± SE. A liña gris representa unha relación 1:1. A correlación intraclase (ICC) de medicións repetidas móstrase na etiqueta do eixe. NAD, nicotinamida adenina dinucleótido. (C) Diagrama esquemático do fluxo de traballo da análise de metabolitos do paciente. As ascites ou tumores recóllense dos pacientes e son crioconservados. Unha pequena porción de cada mostra analizouse mediante citometría de fluxo, mentres que as mostras restantes sometéronse a tres roldas de enriquecemento para células CD4+, CD8+ e CD45-. Estas fraccións celulares analizáronse mediante LC-MS/MS. (D) Mapa de calor da abundancia estandarizada de metabolitos. O dendrograma representa a agrupación de Ward de distancias euclidianas entre mostras. (E) Análise de compoñentes principais (ACP) do mapa de metabolitos da mostra, que mostra tres réplicas de cada mostra; as mostras do mesmo paciente están conectadas por unha liña. (F) ACP do perfil de metabolitos da mostra condicionada no paciente (é dicir, usando redundancia parcial); o tipo de mostra está limitado pola envolvente convexa. ACP1, compoñente principal 1; ACP2, compoñente principal 2.
A continuación, aplicamos este método de enriquecemento para analizar 99 metabolitos nas fraccións de células CD4+, CD8+ e CD45- nas ascites e tumores primarios de seis pacientes con HGSC (Figura 2C, Figura S3A e Táboas S3 e S4). A poboación de interese representa entre o 2 % e o 70 % da gran mostra orixinal de células vivas, e a proporción de células varía moito entre os pacientes. Despois de separar as esferas, a fracción enriquecida de interese (CD4+, CD8+ ou CD45-) representa de media máis do 85 % de todas as células vivas da mostra. Este método de enriquecemento permítenos analizar as poboacións celulares do metabolismo do tecido tumoral humano, o que é imposible de facer con mostras grandes. Usando este protocolo, determinamos que a l-quinurenina e a adenosina, estes dous metabolitos inmunosupresores ben caracterizados, estaban elevados nas células T tumorais ou nas células tumorais (Figura S3, B e C). Polo tanto, estes resultados demostran a fidelidade e a capacidade da nosa tecnoloxía de separación celular e espectrometría de masas para atopar metabolitos bioloxicamente importantes nos tecidos dos pacientes.
A nosa análise tamén revelou unha forte separación metabólica dos tipos de células dentro dos pacientes e entre eles (Figura 2D e Figura S4A). En particular, en comparación con outros pacientes, o paciente 70 mostrou diferentes características metabólicas (Figura 2E e Figura S4B), o que indica que pode haber unha heteroxeneidade metabólica substancial entre os pacientes. Cómpre sinalar que, en comparación con outros pacientes (1,2 a 2 litros; Táboa S1), a cantidade total de ascite recollida no paciente 70 (80 ml) foi menor. O control da heteroxeneidade entre pacientes durante a análise de compoñentes principais (por exemplo, mediante a análise de redundancia parcial) mostra cambios consistentes entre os tipos de células, e os tipos de células e/ou o microambiente están claramente agregados segundo o perfil de metabolitos (Figura 2F). A análise de metabolitos individuais salientou estes efectos e revelou diferenzas significativas entre os tipos de células e o microambiente. Cómpre sinalar que a diferenza máis extrema observada é o MNA, que normalmente está enriquecido en células CD45- e en células CD4+ e CD8+ que se infiltran no tumor (Figura 3A). Para as células CD4+, este efecto é máis obvio, e o MNA nas células CD8+ tamén parece verse fortemente afectado polo ambiente. Non obstante, isto non é importante, porque só tres dos seis pacientes poden ser avaliados para as puntuacións CD8+ tumorais. Ademais do MNA, en diferentes tipos de células en ascite e tumores, outros metabolitos que están pouco caracterizados en TIL tamén son diferencialmente ricos (figuras S3 e S4). Polo tanto, estes datos revelan un conxunto prometedor de metabolitos inmunomoduladores para futuras investigacións.
(A) Contido normalizado de MNA en células CD4+, CD8+ e CD45- de ascite e tumor. O diagrama de caixa mostra a mediana (liña), o rango intercuartílico (bisagra do marco) e o rango de datos, ata 1,5 veces o rango intercuartílico (bigote do marco). Como se describe en Materiais e métodos para pacientes, use o valor limma do paciente para determinar o valor P (*P<0,05 e **P<0,01). (B) Diagrama esquemático do metabolismo do MNA (60). Metabolitos: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-homocisteína; NA, nicotinamida; MNA, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridona-5-carboxamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida; NR, nicotinamida ribosa; NMN, mononucleótido de nicotinamida. Enzimas (verde): NNMT, nicotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuínas; NAMPT, nicotinamida fosforribosiltransferase; AOX1, aldehído oxidase 1; NRK, nicotinamida ribosido quinase; NMNAT, nicotinamida mononucleótido adenilato transferase; Pnp1, purina nucleósido fosforilase. (C) t-SNE de scRNA-seq de ascite (gris) e tumor (vermello; n = 3 pacientes). (D) Expresión de NNMT en diferentes poboacións celulares identificadas mediante scRNA-seq. (E) Expresión de NNMT e AOX1 en SK-OV-3, ril embrionario humano (HEK) 293T, células T e células T tratadas con MNA. A expresión pregada móstrase en relación con SK-OV-3. Móstrase o patrón de expresión con SEM (n = 6 doantes sans). Os valores de Ct superiores a 35 considéranse indetectables (UD). (F) Expresión de SLC22A1 e SLC22A2 en células SK-OV-3, HEK293T, células T e células T tratadas con 8 mM de MNA. Móstrase a expresión pregada en relación con SK-OV-3. Móstrase o patrón de expresión con SEM (n = 6 doantes sans). Os valores de Ct superiores a 35 considéranse indetectables (UD). (G) Contido de MNA celular en células T doantes sans activadas despois de 72 horas de incubación con MNA. Móstrase o patrón de expresión con SEM (n = 4 doantes sans).
O MNA prodúcese transferindo o grupo metilo da S-adenosil-1-metionina (SAM) á nicotinamida (NA) mediante a nicotinamida N-metiltransferase (NNMT; Figura 3B). O NNMT está sobreexpresado nunha variedade de cancros humanos e está asociado coa proliferación, invasión e metástase (25-27). Para comprender mellor a fonte do MNA nas células T na TME, empregamos scRNA-seq para caracterizar a expresión de NNMT en diferentes tipos de células na ascite e nos tumores de tres pacientes con HGSC (Táboa S5). A análise de aproximadamente 6.500 células mostrou que na ascite e nos ambientes tumorais, a expresión de NNMT estaba restrinxida ás presuntas poboacións de fibroblastos e células tumorais (Figura 3, C e D). Cómpre sinalar que non hai unha expresión obvia de NNMT en ningunha poboación que exprese PTPRC (CD45+) (Figura 3D e Figura S5A), o que indica que o MNA detectado no espectro de metabolitos foi introducido nas células T. A expresión da aldehído oxidase 1 (AOX1) converte o MNA en 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) ou 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4-PYR); Figura 3B) tamén está restrinxida á poboación de fibroblastos que expresan COL1A1 (Figura S5A), o que en conxunto indica que as células T carecen da capacidade do metabolismo convencional do MNA. O patrón de expresión destes xenes relacionados co MNA verificouse utilizando un segundo conxunto de datos celulares independentes procedentes de ascite de pacientes con HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Ademais, a análise da reacción en cadea da polimerase cuantitativa (qPCR) de células T doadoras sas tratadas con MNA mostrou que, en comparación coas células tumorais ovarianas SK-OV-3 de control, a NNMT ou AOX1 case non se expresaban (Figura 3E). Estes resultados inesperados indican que o MNA pode ser segregado por fibroblastos ou tumores ás células T adxacentes no TME.
Aínda que entre os candidatos inclúense a familia de transportadores de catións orgánicos 1 a 3 (OCT1, OCT2 e OCT3) codificados pola familia do transportador soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 e SLC22A3), os posibles transportadores de MNA aínda non están definidos (28). A QPCR do ARNm de células T doantes sas mostrou niveis baixos de expresión de SLC22A1, pero niveis indetectables de SLC22A2, o que confirmou que xa se publicara na literatura (Figura 3F) (29). En contraste, a liña celular tumoral ovárica SK-OV-3 expresou niveis altos de ambos transportadores (Figura 3F).
Para comprobar a posibilidade de que as células T teñan a capacidade de absorber MNA alleo, cultiváronse células T doantes sans durante 72 horas en presenza de diferentes concentracións de MNA. En ausencia de MNA exóxeno, non se pode detectar o contido celular de MNA (Figura 3G). Non obstante, as células T activadas tratadas con MNA exóxeno mostraron un aumento dependente da dose no contido de MNA nas células, de ata 6 mM de MNA (Figura 3G). Este resultado indica que, a pesar do baixo nivel de expresión do transportador e da falta do principal encima responsable do metabolismo intracelular do MNA, o TIL aínda pode absorber MNA.
O espectro de metabolitos nas células T dos pacientes e os experimentos de absorción de MNA in vitro aumentan a posibilidade de que os fibroblastos asociados ao cancro (CAF) segreguen MNA e as células tumorais poidan regular o fenotipo e a función do TIL. Para determinar o efecto do MNA nas células T, activáronse in vitro células T doantes sans en presenza ou ausencia de MNA, e avaliouse a súa proliferación e produción de citocinas. Despois de 7 días de engadir MNA na dose máis alta, o número de duplicación da poboación reduciuse moderadamente, mentres que o vigor se mantivo en todas as doses (Figura 4A). Ademais, o tratamento con MNA exóxeno resultou nun aumento na proporción de células T CD4+ e CD8+ que expresan o factor de necrose tumoral α (TNFα; Figura 4B). En contraste, a produción intracelular de IFN-γ reduciuse significativamente nas células T CD4+, pero non nas células T CD8+, e non houbo un cambio significativo na interleucina 2 (IL-2; Figura 4, C e D). Polo tanto, o ensaio inmunoabsorbente ligado a encimas (ELISA) dos sobrenadantes destes cultivos de células T tratadas con MNA mostrou un aumento significativo no TNFα, unha diminución no IFN-γ e ningún cambio na IL-2 (Figura 4, E a G). A diminución do IFN-γ indica que o MNA pode desempeñar un papel na inhibición da actividade antitumoral das células T. Para simular o efecto do MNA na citotoxicidade mediada por células T, as células T do receptor de antíxeno quimérico (FRα-CAR-T) dirixidas ao receptor de folato α e ás células CAR-T (GFP) reguladas pola proteína verde fluorescente (GFP) -CAR-T son producidas por células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doantes sans. As células CAR-T cultiváronse durante 24 horas en presenza de MNA e despois cocultiváronse con células tumorais ováricas humanas SK-OV-3 que expresan o receptor de folato α nunha proporción efector-diana de 10:1. O tratamento con MNA provocou unha diminución significativa na actividade destrutiva das células FRα-CAR-T, que foi similar ás células FRα-CAR-T tratadas con adenosina (Figura 4H).
(A) Reconto total de células viables e duplicación da poboación (PD) directamente do cultivo no día 7. O gráfico de barras representa a media + SEM de seis doantes sans. Representa datos de polo menos n = 3 experimentos independentes. (B a D) CD3/CD28 e IL-2 utilizáronse para activar as células T nas súas respectivas concentracións de MNA durante 7 días. Antes da análise, as células estimuláronse con PMA/ionomicina con GolgiStop durante 4 horas. Expresión de TNFα (B) en células T. Imaxe de exemplo (esquerda) e datos tabulares (dereita) da expresión de TNFα en células vivas. Expresión de IFN-γ (C) e IL-2 (D) en células T. A expresión de citocinas mediuse por citometría de fluxo. O gráfico de barras representa a media (n = 6 doantes sans) + SEM. Use análise unidireccional da varianza e medidas repetidas (*P<0,05 e **P<0,01) para determinar o valor P. Representa datos de polo menos n = 3 experimentos independentes. (E a G) Usáronse CD3/CD28 e IL-2 para activar as células T nas súas respectivas concentracións de MNA durante 7 días. O medio recolleuse antes e despois de 4 horas de estimulación con PMA/ionomicina. As concentracións de TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) medíronse mediante ELISA. O gráfico de barras representa a media (n = 5 doantes sans) + SEM. Valor P determinado mediante análise unidireccional da varianza e medicións repetidas (*P<0,05). A liña punteada indica o límite de detección da detección. (H) Ensaio de lise celular. As células FRα-CAR-T ou GFP-CAR-T axustáronse con adenosina (250 μM) ou MNA (10 mM) durante 24 horas ou deixáronse sen tratar (Ctrl). Medíuse a porcentaxe de destrución de células SK-OV-3. Valor P determinado mediante a proba t de Welch (*P<0,5 e **P<0,01).
Para comprender mellor a mecánica da regulación da expresión de TNFα dependente do MNA, avaliáronse os cambios no ARNm de TNFα das células T tratadas con MNA (Figura 5A). As células T doantes sans tratadas con MNA mostraron un aumento do dobre nos niveis de transcrición de TNFα, o que indica que o MNA depende da regulación transcricional de TNFα. Para investigar este posible mecanismo regulador, avaliáronse dous factores de transcrición coñecidos que regulan o TNFα, concretamente o factor nuclear de células T activado (NFAT) e a proteína específica 1 (Sp1), en resposta á unión do MNA ao promotor proximal de TNFα (30). O promotor de TNFα contén 6 sitios de unión de NFAT identificados e 2 sitios de unión de Sp1, que se superpoñen nun sitio [-55 pares de bases (pb) desde a cápsula 5'] (30). A inmunoprecipitación da cromatina (ChIP) mostrou que, cando se trataba con MNA, a unión de Sp1 ao promotor de TNFα aumentaba o triplo. A incorporación de NFAT tamén aumentaba e se achegaba á importancia (Figura 5B). Estes datos indican que o MNA regula a expresión de TNFα a través da transcrición de Sp1 e, en menor medida, a expresión de NFAT.
(A) En comparación coas células T cultivadas sen MNA, o cambio de pregamento da expresión de TNFα en células T tratadas con MNA. Móstrase o patrón de expresión con SEM (n = 5 doantes sans). Representa datos de polo menos n = 3 experimentos independentes. (B) O promotor de TNFα das células T tratadas con ou sen 8 mM de MNA despois de que NFAT e Sp1 se combinasen con (Ctrl) e estimulación con PMA/ionomicina durante 4 horas. A inmunoglobulina G (IgG) e H3 utilizáronse como controis negativos e positivos para a inmunoprecipitación, respectivamente. A cuantificación de ChIP mostrou que a unión de Sp1 e NFAT ao promotor de TNFα nas células tratadas con MNA aumentou varias veces en comparación co control. Representa datos de polo menos n = 3 experimentos independentes. Valor P determinado por múltiples probas t (*** P <0,01). (C) En comparación coa ascite de HGSC, as células T (non citotóxicas) mostraron unha maior expresión de TNF no tumor. As cores representan diferentes pacientes. As células mostradas foron mostradas aleatoriamente ata 300 e axustadas para limitar a sobrecarga (** Padj = 0,0076). (D) Modelo proposto de MNA para o cancro de ovario. O MNA prodúcese en células tumorais e fibroblastos na TME e é absorbido polas células T. O MNA aumenta a unión de Sp1 ao promotor do TNFα, o que leva a un aumento da transcrición do TNFα e da produción de citocinas do TNFα. O MNA tamén provoca unha diminución do IFN-γ. A inhibición da función das células T leva a unha redución da capacidade de destrución e a un crecemento tumoral acelerado.
Segundo os informes, o TNFα ten efectos antitumorais e antitumorais frontais e traseiros, pero ten un papel ben coñecido na promoción do crecemento e a metástase do cancro de ovario (31-33). Segundo os informes, a concentración de TNFα na ascite e nos tecidos tumorais en pacientes con cancro de ovario é maior que nos tecidos benignos (34-36). En termos de mecanismo, o TNFα pode regular a activación, a función e a proliferación dos glóbulos brancos e cambiar o fenotipo das células cancerosas (37, 38). En consonancia con estes achados, a análise da expresión xénica diferencial mostrou que o TNF estaba significativamente regulado positivamente nas células T nos tecidos tumorais en comparación coa ascite (Figura 5C). O aumento da expresión de TNF só foi evidente nas poboacións de células T cun fenotipo non citotóxico (Figura S5A). En resumo, estes datos apoian a idea de que o MNA ten efectos inmunosupresores e promotores de tumores dobres no HGSC.
O marcado fluorescente baseado na citometría de fluxo converteuse no principal método para estudar o metabolismo dos TIL. Estes estudos demostraron que, en comparación cos linfocitos do sangue periférico ou as células T de órganos linfoides secundarios, os TIL murinos e humanos teñen unha maior tendencia á absorción de glicosa (4, 39) e á perda gradual da función mitocondrial (19, 40). Aínda que observamos resultados similares neste estudo, o desenvolvemento clave é comparar o metabolismo das células tumorais e os TIL do mesmo tecido tumoral resecado. En consonancia con algúns destes informes previos, as células tumorais (CD45-EpCAM+) de ascite e tumores teñen unha maior absorción de glicosa que as células T CD8+ e CD4+, o que apoia que a alta absorción de glicosa das células tumorais pódese comparar coas células T. O concepto de competencia das células T. TME. Non obstante, a actividade mitocondrial das células tumorais é maior que a das células T CD8+, pero a actividade mitocondrial é similar á das células T CD4+. Estes resultados reforzan o tema emerxente de que o metabolismo oxidativo é importante para as células tumorais (41, 42). Tamén suxiren que as células T CD8+ poden ser máis susceptibles á disfunción oxidativa que as células T CD4+, ou que as células T CD4+ poden usar fontes de carbono distintas da glicosa para manter a actividade mitocondrial (43, 44). Cómpre sinalar que non observamos ningunha diferenza na captación de glicosa ou na actividade mitocondrial entre os efectores T CD4+, a memoria do efector T e as células T de memoria central en ascite. Do mesmo xeito, o estado de diferenciación das células T CD8+ nos tumores non ten nada que ver cos cambios na captación de glicosa, o que destaca a diferenza significativa entre as células T cultivadas in vitro e as TIL humanas in vivo (22). Estas observacións tamén se confirmaron mediante o uso da asignación automática e imparcial da poboación celular, que revelou ademais que as células CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ con maior captación de glicosa e actividade mitocondrial que as células tumorais son prevalentes pero teñen unha poboación celular metabólicamente activa. Esta poboación pode representar a suposta subpoboación de células supresoras mieloides ou células dendríticas plasmocitoides identificadas na análise scRNA-seq. Aínda que ambos foron descritos en tumores ováricos humanos [45], aínda precisan máis traballo para describir esta subpoboación mieloide.
Aínda que os métodos baseados en citometría de fluxo poden clarificar as diferenzas xerais no metabolismo da glicosa e oxidativo entre os tipos de células, os metabolitos precisos producidos pola glicosa ou outras fontes de carbono para o metabolismo mitocondrial na TME aínda non foron determinados. Asignar a presenza ou ausencia de metabolitos a un subconxunto TIL determinado require a purificación da poboación celular do tecido extirpado. Polo tanto, o noso método de enriquecemento celular combinado coa espectrometría de masas pode proporcionar información sobre os metabolitos que se enriquecen diferencialmente nas células T e nas poboacións de células tumorais en mostras de pacientes coincidentes. Aínda que este método ten vantaxes sobre a clasificación celular activada por fluorescencia, certas bibliotecas de metabolitos poden verse afectadas debido á estabilidade inherente e/ou á rápida taxa de renovación (22). Non obstante, o noso método foi capaz de identificar dous metabolitos inmunosupresores recoñecidos, adenosina e quinurenina, porque varían moito entre os tipos de mostra.
A nosa análise metabonómica de tumores e subtipos de TIL proporciona máis información sobre o papel dos metabolitos na TME ovárica. En primeiro lugar, mediante citometría de fluxo, determinamos que non había diferenza na actividade mitocondrial entre os tumores e as células T CD4+. Non obstante, a análise LC-MS/MS revelou cambios significativos na abundancia de metabolitos entre estas poboacións, o que indica que as conclusións sobre o metabolismo do TIL e a súa actividade metabólica xeral requiren unha interpretación coidadosa. En segundo lugar, o MNA é o metabolito coa maior diferenza entre as células CD45 e as células T na ascite, non nos tumores. Polo tanto, a compartimentación e a localización do tumor poden ter efectos diferentes sobre o metabolismo do TIL, o que destaca a posible heteroxeneidade nun microambiente determinado. En terceiro lugar, a expresión do encima produtor de MNA NNMT limítase principalmente á CAF, que son células tumorais en menor medida, pero obsérvanse niveis detectables de MNA nas células T derivadas do tumor. A sobreexpresión de NNMT na CAF ovárica ten un coñecido efecto promotor do cancro, en parte debido á promoción do metabolismo da CAF, a invasión tumoral e a metástase (27). Aínda que o nivel xeral de TIL é moderado, a expresión de NNMT na CAF está estreitamente relacionada co subtipo mesenquimal do Atlas do Xenoma do Cancro (TCGA), que se asocia cun mal prognóstico (27, 46, 47). Finalmente, a expresión do encima AOX1 responsable da degradación do MNA tamén está limitada á poboación CAF, o que indica que as células T carecen da capacidade de metabolizar o MNA. Estes resultados apoian a idea de que, aínda que se necesita máis traballo para verificar este achado, os niveis elevados de MNA nas células T poden indicar a presenza dun microambiente CAF inmunosupresor.
Dado o baixo nivel de expresión dos transportadores de MNA e os niveis indetectábeis de proteínas clave implicadas no metabolismo do MNA, a presenza de MNA nas células T é inesperada. Nin a NNMT nin a AOX1 puideron ser detectadas mediante análise de scRNA-seq e qPCR dirixida de dúas cohortes independentes. Estes resultados indican que o MNA non é sintetizado polas células T, senón que se absórbe do TME circundante. Os experimentos in vitro mostran que as células T tenden a acumular MNA exóxeno.
Os nosos estudos in vitro demostraron que o MNA exóxeno induce a expresión de TNFα nas células T e potencia a unión de Sp1 ao promotor do TNFα. Aínda que o TNFα ten funcións tanto antitumorais como antitumorais, no cancro de ovario, o TNFα pode promover o crecemento do cancro de ovario (31-33). A neutralización do TNFα no cultivo de células tumorais ovarianas ou a eliminación do sinal do TNFα en modelos de rato pode mellorar a produción de citocinas inflamatorias mediada por TNFα e inhibir o crecemento tumoral (32, 35). Polo tanto, neste caso, o MNA derivado do TME pode actuar como un metabolito proinflamatorio a través dun mecanismo dependente de TNFα a través do bucle autócrino, promovendo así a aparición e propagación do cancro de ovario (31). Baseándose nesta posibilidade, o bloqueo do TNFα está a ser estudado como un posible axente terapéutico para o cancro de ovario (37, 48, 49). Ademais, o MNA prexudica a citotoxicidade das células CAR-T para as células tumorais ovarianas, o que proporciona máis evidencia da supresión inmunitaria mediada por MNA. Conxuntamente, estes resultados suxiren un modelo no que os tumores e as células CAF segregan MNA no TME extracelular. A través de (i) a estimulación do crecemento do cancro de ovario inducida por TNF e (ii) a inhibición da actividade citotóxica das células T inducida por MNA, isto pode ter un efecto tumoral dual (Figura 5D).
En conclusión, mediante a aplicación dunha combinación de enriquecemento celular rápido, secuenciación unicelular e perfís metabólicos, este estudo revelou as enormes diferenzas inmunometabolómicas entre tumores e células de ascite en pacientes con HGSC. Esta análise exhaustiva mostrou que existen diferenzas na captación de glicosa e na actividade mitocondrial entre as células T, e identificou o MNA como un metabolito regulador inmunitario autónomo non celular. Estes datos teñen un impacto en como o TME afecta o metabolismo das células T nos cancros humanos. Aínda que se informou da competencia directa polos nutrientes entre as células T e as células cancerosas, os metabolitos tamén poden actuar como reguladores indirectos para promover a progresión tumoral e posiblemente suprimir as respostas inmunitarias endóxenas. Unha descrición máis detallada do papel funcional destes metabolitos reguladores pode abrir estratexias alternativas para mellorar a resposta inmunitaria antitumoral.
As mostras e os datos clínicos dos pacientes obtivéronse a través do repositorio de tecidos tumorais de cancro de Columbia Británica certificado pola Canadian Tissue Repository Network. Segundo o protocolo aprobado polo BC Cancer Ethics Research Committee e a Universidade da Columbia Británica (H07-00463), todas as mostras e datos clínicos dos pacientes obtiveron o consentimento informado por escrito ou renunciaron formalmente ao seu consentimento. As mostras almacénanse no BioBank certificado (BRC-00290). As características detalladas dos pacientes móstranse nas táboas S1 e S5. Para a criopreservación, utilízase un bisturí para descompoñer mecanicamente a mostra tumoral do paciente e despois empúxase a través dun filtro de 100 micras para obter unha suspensión de células individuais. A ascite do paciente centrifugouse a 1500 rpm durante 10 minutos a 4 °C para sedimentar as células e eliminar o sobrenadante. As células obtidas de tumores e ascites foron crioconservadas en soro AB humano inactivado por calor ao 50 % (Sigma-Aldrich), RPMI-1640 ao 40 % (Thermo Fisher Scientific) e dimetilsulfóxido ao 10 %. Estas suspensións de células individuais conservadas foron desconxeladas e utilizadas para a metabolómica e a determinación de metabolitos que se describen a continuación.
O medio completo consiste en RPMI 1640: AimV filtrado a 0,22 μm suplementado ao 50:50. RPMI 1640 + 2,05 mM de l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) suplementado cun 10 % de soro AB humano inactivado por calor (Sigma-Aldrich), 12,5 mM de Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM de l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) (Fisher Scientific), 1 solución de penicilina-estreptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) e 50 μMB de mercaptoetanol. AimV (Invitrogen) está suplementado con 20 mM de Hepes (Thermo Fisher Scientific) e 2 mM de l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). O tampón de tinguidura do citómetro de fluxo consistiu en 0,22 μm de solución salina tamponada con fosfato (PBS; Invitrogen) filtrada e suplementada cun 3 % de soro AB humano inactivado por calor (Sigma). O tampón de enriquecemento celular está composto de PBS filtrado a 0,22 μm e suplementado con soro AB humano inactivado por calor ao 0,5 % (Sigma-Aldrich).
Nun medio completo a 37 °C, as células foron tinguidas con 10 nM de MT DR e 100 μM de 2-NBDG durante 30 minutos. A continuación, as células foron tinguidas co colorante de viabilidade eF506 a 4 °C durante 15 minutos. Resuspender as células en FC Block (eBioscience) e Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluír en tampón de tinguidura para citómetro de fluxo (segundo as instrucións do fabricante) e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tinguir as células cun conxunto de anticorpos (Táboa S2) en tampón de tinguidura para citometría de fluxo a 4 °C durante 20 minutos. Resuspender as células en tampón de tinguidura para citometría de fluxo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) antes da análise. Usar SpectroFlo e FlowJo V10 para analizar os datos de reconto celular e usar GraphPad Prism 8 para crear os datos. A intensidade media de fluorescencia (MFI) de 2-NBDG e MT DR normalizouse logarítmicamente e, a continuación, utilizouse unha proba t pareada para a análise estatística para ter en conta os pacientes emparellados. Elimine todas as poboacións con menos de 40 eventos da análise; introduza un valor de MFI de 1 para calquera valor negativo antes de realizar a análise estatística e a visualización de datos.
Para complementar a estratexia de control manual do panel de procesos anterior, empregamos a anotación completa da árbore de restrición de forma (FAUST) (21) para asignar automaticamente as células á poboación despois de eliminar as células mortas en FlowJo. Xestionamos manualmente a saída para fusionar as poboacións que parecen estar mal asignadas (combinando células PD1+ con células tumorais PD1) e as poboacións retidas. Cada mostra contén unha media de máis do 2 % de células, para un total de 11 poboacións.
Utilizouse a centrifugación de densidade en gradiente de Ficoll para separar as células mononucleares de células periféricas (PBMC) dos produtos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies). As células T CD8+ illáronse das PBMC utilizando microesferas CD8 (Miltenyi) e expandíronse en medio completo utilizando TransAct (Miltenyi) durante 2 semanas segundo as instrucións do fabricante. Deixáronse repousar as células durante 5 días en medio completo que contiña IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) e despois reestimularonse con TransAct. No día 7, segundo as instrucións do fabricante, utilizáronse microesferas CD45 humanas (Miltenyi) para enriquecer as células en tres roldas consecutivas. As células alícuotáronse para a análise por citometría de fluxo (como se describe anteriormente) e alícuotáronse un millón de células tres veces para a análise LC-MS/MS. As mostras procesáronse mediante LC-MS/MS como se describe a continuación. Estimamos o valor do metabolito que falta cun número de ións de 1000. Cada mostra normalízase polo número total de ións (TIC), convértese logaritmicamente e normalízase automaticamente en MetaboAnalystR antes da análise.
A suspensión de células individuais de cada paciente desconxelouse e filtrouse a través dun filtro de 40 μm ata obter un medio completo (como se describiu anteriormente). Segundo o protocolo do fabricante, utilizáronse tres roldas consecutivas de selección positiva mediante separación de esferas magnéticas con MicroBeads (Miltenyi) para enriquecer as mostras con células CD8+, CD4+ e CD45- (en xeo). En resumo, as células resuspéndense en tampón de enriquecemento celular (como se describiu anteriormente) e contáronse. As células incubáronse con esferas CD8 humanas, esferas CD4 humanas ou esferas CD45 humanas (Miltenyi) a 4 °C durante 15 minutos e despois laváronse con tampón de enriquecemento celular. A mostra pásase pola columna LS (Miltenyi) e recóllense as fraccións positivas e negativas. Para reducir a duración e maximizar o paso de recuperación celular, a fracción CD8 utilízase para a segunda rolda de enriquecemento con CD4+ e a fracción CD4 utilízase para o posterior enriquecemento con CD45. Manteña a solución en xeo durante todo o proceso de separación.
Para preparar as mostras para a análise de metabolitos, as células laváronse unha vez cunha solución salina xeada e engadíuselle 1 ml de metanol ao 80 % a cada mostra, despois axitáronse en vórtice e conxeláronse rapidamente en nitróxeno líquido. As mostras sometéronse a tres ciclos de conxelación-desconxelación e centrifugáronse a 14 000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante que contén os metabolitos evapórase ata que se seca. Os metabolitos redisolvéronse en 50 μl de ácido fórmico ao 0,03 %, axitáronse en vórtice para mesturalos e despois centrifugáronse para eliminar os residuos.
Extraer os metabolitos como se describiu anteriormente. Transferir o sobrenadante a un frasco de cromatografía líquida de alta resolución para a investigación metabolómica. Empregar un protocolo de tratamento aleatorio para tratar cada mostra cun número similar de células para evitar efectos de lote. Realizamos unha avaliación cualitativa dos metabolitos globais publicada previamente no espectrómetro de masas de triplo cuadrupolo AB SCIEX QTRAP 5500 (50). A análise cromatográfica e a integración da área dos picos realizáronse usando o software MultiQuant versión 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Utilizouse unha conta de ións de 1000 para estimar o valor do metabolito ausente e o TIC de cada mostra utilizouse para calcular a área do pico normalizada de cada metabolito detectado para corrixir os cambios introducidos pola análise instrumental do procesamento da mostra. Despois de normalizar o TIC, utilízase MetaboAnalystR(51) (parámetro predeterminado) para a conversión logarítmica e a escala automática da liña de normas. Empregamos PCA co paquete R vegano para realizar unha análise exploratoria das diferenzas do metaboloma entre os tipos de mostra e empregamos unha análise de redundancia parcial para analizar os pacientes. Empregamos o método de Ward para construír un dendrograma de mapa de calor para agrupar a distancia euclidiana entre as mostras. Empregamos limma (52) na abundancia de metabolitos estandarizados para identificar metabolitos diferencialmente abundantes en todo o tipo de célula e o microambiente. Para simplificar a explicación, usamos o parámetro da media do grupo para especificar o modelo e consideramos os tipos de células no microambiente como cada grupo (n = 6 grupos); para a proba de significación, realizamos tres medicións repetidas para cada metabolito. Para evitar unha falsa replicación, o paciente incluíuse como un obstáculo no deseño de limma. Para comprobar as diferenzas nos metabolitos entre diferentes pacientes, axustamos o modelo limma incluíndo pacientes dun xeito fixo. Informamos da significación do contraste preespecificado entre o tipo de célula e o microambiente de Padj <0,05 (corrección de Benjamini-Hochberg).
Tras o enriquecemento en vigor empregando o kit de eliminación de células mortas de Miltenyi (viabilidade >80 %), realizouse a secuenciación do transcriptoma unicelular no total de mostras de ascite e tumores conxeladas vivas empregando un protocolo de expresión xénica de 10x 5′. Analizáronse cinco casos con tumores e ascite coincidentes, aínda que a baixa viabilidade dunha mostra de tumor impediu a súa inclusión. Para lograr seleccións múltiples de pacientes, combinamos as mostras de cada paciente nos carrís do controlador de cromo 10x e analizamos as ascite e os sitios tumorais por separado. Tras a secuenciación [Illumina HiSeq 4000 extremos emparellados (PE) de 28×98 pb, xenoma de Quebec; cunha media de 73.488 e 41.378 lecturas por célula para tumor e ascite respectivamente]], empregamos CellSNP e Vireo (53) (baseados en CellSNP como Ao SNP humano común (VCF) proporcionado por GRCh38 asígnaselle unha identidade de doante. Usamos SNPRelate para inferir a identidade máis próxima (IBS) do estado xenético do paciente (IBS), excluíndo as células non asignadas e as células identificadas como dúplex e doantes coincidentes entre ascite e mostras tumorais (54). Con base nesta tarefa, conservamos tres casos con representación celular abundante no tumor e na ascite para a análise posterior. Despois de realizar un paso de filtración masiva no empaquetado BioConductor scater (55) e scran (56), isto produciu 6975 células (2792 e 4183 células de tumor e ascite, respectivamente) para a análise. Usamos a agrupación de Louvain (57) de igraph da rede de veciños máis próximos compartida (SNN) baseada na distancia de Jaccard ás células do clúster por expresión. Os clústeres foron anotados manualmente aos posibles tipos de células baseándose na expresión do xene marcador e visualizados con t-SNE. As células T citotóxicas defínense pola expresión de CD8A e GZMA, excluíndo os subclústeres con baixa expresión de proteínas ribosómicas. Accedemos aos datos publicados de Izar et al. (16), incluíndo a súa inclusión de t-SNE, que pode controlar a superposición de expresión entre os marcadores de células inmunitarias e a expresión de NNMT.
As PBMC separáronse dos produtos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación de densidade en gradiente de Ficoll. As células CD3+ illáronse das PBMC usando esferas CD3 (Miltenyi). En presenza ou ausencia de MNA, as células CD3+ activáronse con CD3 unido á placa (5 μg/ml), CD28 soluble (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin). No último día de expansión, avaliouse a viabilidade (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) e a proliferación (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) mediante citometría de fluxo. Avaliar a función efectora estimulando as células con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) con GolgiStop durante 4 horas e monitorizar CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) e isotiocianato de TNFα-fluoresceína (FITC) (MAb11, BD). Estimular as células qPCR e ChIP con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) durante 4 horas. O sobrenadante de ELISA recolleuse antes e despois da estimulación con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) durante 4 horas.
Siga o protocolo do fabricante para illar o ARN usando o kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Use QIAshredder (QIAGEN) para homoxeneizar a mostra. Use o kit de ARN a ADNc de alta capacidade (Thermo Fisher Scientific) para sintetizar ADN complementario (ADNc). Use TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) para cuantificar a expresión xénica (segundo o protocolo do fabricante) coas seguintes sondas: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehído-3-fosfato de hidróxeno (GAPDH)] e Hs01010726_m1 (SLC22A2). As mostras executáronse no sistema de PCR en tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) na placa de reacción óptica rápida de 96 pozos MicroAmp (Applied Biosystems) con película óptica MicroAmp. Calquera valor de Ct que supere 35 considérase superior ao limiar de detección e márcase como indetectable.
Realizar o ChIP como se describiu previamente (58). En resumo, as células tratáronse con formaldehido (concentración final 1,42 %) e incubáronse a temperatura ambiente durante 10 minutos. Usar tampón de inchazo suplementado (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl e 0,1 % NP-40) en xeo durante 10 minutos e, a continuación, resuspender en tampón de inmunoprecipitación como se describe (58). A continuación, a mostra sonicouse cos seguintes ciclos: 10 ciclos (20 pulsos de 1 segundo) e un tempo estático de 40 segundos. Incubar inmunoglobulina G de grao ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) e anticorpos SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) coa mostra a 4 °CC, axitando durante a noite. Incubar as esferas de proteína A (Thermo Fisher Scientific) coa mostra a 4 °C con axitación suave durante 1 hora, despois usar esferas chelex (Bio-Rad) para enriquecer o ADN e usar proteinase K (Thermo Fisher) para a dixestión das proteínas. O promotor do TNFα detectouse por PCR: directa, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; pola contra, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produto de 207 pb). As imaxes foron producidas por Image Lab (Bio-Rad) e cuantificadas usando o software ImageJ.
O sobrenadante do cultivo celular recolleuse como se describiu anteriormente. A determinación levouse a cabo segundo os procedementos do fabricante do kit ELISA de TNFα humano (Invitrogen), o kit ELISA de IL-2 humana (Invitrogen) e o kit ELISA de IFN-γ humano (Abcam). Segundo o protocolo do fabricante, o sobrenadante diluíuse 1:100 para detectar TNFα e IL-2 e 1:3 para detectar IFN-γ. Empregouse o lector multilabel EnVision 2104 (PerkinElmer) para medir a absorbancia a 450 nm.
As PBMC separáronse dos produtos de separación de leucocitos (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación de densidade en gradiente de Ficoll. As células CD3+ illáronse das PBMC usando esferas CD3 (Miltenyi). En presenza ou ausencia de MNA, as células CD3+ activáronse con CD3 unido á placa (5 μg/ml), CD28 soluble (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin) durante 3 días. Despois de 3 días, as células recolléronse e laváronse con solución salina ao 0,9 %, e o precipitado conxelouse rapidamente. A contaxe celular realizouse por citometría de fluxo (Cytek Aurora; configuración 3L-16V-14B-8R) usando esferas eBeads de 123 contas.
Extraer os metabolitos como se describiu anteriormente. O extracto seco reconstituíuse a unha concentración de 4000 equivalentes celulares/μl. Analizar a mostra mediante cromatografía de fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e columna CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, tamaño de partícula 1,6 μm, tamaño de poro 120 Å; #186008500, Waters). Espectrómetro de masas polar (6470, Agilent), no que a ionización por electropulverización funciona en modo positivo. A fase móbil A é ácido fórmico ao 0,1 % (en H2O), a fase móbil B é acetonitrilo ao 90 % e ácido fórmico ao 0,1 %. O gradiente de LC é de 0 a 2 minutos para A ao 100 %, de 2 a 7,1 minutos para B ao 99 % e de 7,1 a 8 minutos para B ao 99 %. Despois, reequilibrar a columna coa fase móbil A a un caudal de 0,6 ml/min durante 3 minutos. O caudal é de 0,4 ml/min e a cámara da columna quéntase a 50 °C. Usar o estándar químico puro de MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canadá) para establecer o tempo de retención (RT) e a transformación (RT = 0,882 minutos, transformación 1 = 137→94,1, transformación 2 = 137→92, conversión 3 = 137→78). Cando as tres transicións se producen no tempo de retención correcto, a transición 1 úsase para a cuantificación para garantir a especificidade. A curva estándar de MNA (Toronto Research Chemical Company) xerouse mediante seis dilucións seriadas da solución stock (1 mg/ml) para obter estándares de 0,1, 1,0, 10 e 100 ng/ml e 1,0 e 10 μg/ml de líquido, respectivamente. O límite de detección é de 1 ng/ml e a resposta lineal está entre 10 ng/ml e 10 μg/ml. Cada inxección de dous microlitros de mostra e estándar utilízase para a análise LC/MS, e execútase unha mostra de control de calidade mixta cada oito inxeccións para garantir a estabilidade da plataforma de análise. As respostas de MNA de todas as mostras celulares tratadas con MNA estiveron dentro do rango lineal do ensaio. A análise de datos realizouse utilizando o software de análise cuantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
A construción αFR-CAR de segunda xeración foi tomada de Song et al. (59). En resumo, a construción contén o seguinte contido: secuencia líder CD8a, fragmento variable de cadea simple específico de αFR humano, rexión bisagra e transmembrana CD8a, dominio intracelular CD27 e dominio intracelular CD3z. A secuencia CAR completa sintetizouse mediante GenScript e, a continuación, clonouse no vector de expresión lentiviral de segunda xeración augas arriba do casete de expresión GFP empregado para avaliar a eficiencia da transdución.
O lentivirus prodúcese mediante a transfección de células HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC)]; cultiváronse en medio Eagle modificado por Dulbecco que contiña un 10 % de soro fetal bovino (FBS) e un 1 % de PenStrep, e utilizouse o vector CAR-GFP. Os plásmidos de empaquetamento (psPAX2 e pMD2.G, Addgene) usan amina de lipofección (Sigma-Aldrich). O sobrenadante que contiña o virus recolleuse 48 e 72 horas despois da transfección, filtrouse e concentrouse por ultracentrifugación. Gardase o sobrenadante viral concentrado a -80 °C ata a transdución.
As PBMC sepáranse dos produtos de separación de leucocitos de doantes sans (STEMCELL Technologies) mediante centrifugación de densidade en gradiente de Ficoll. Usar microesferas CD8 de selección positiva (Miltenyi) para illar as células CD8+ das PBMC. Estimular as células T con TransAct (Miltenyi) e en medio TexMACS [Miltenyi; suplementado con soro humano inactivado por calor ao 3 %, PenStrep ao 1 % e IL-2 (300 U/ml)]. Vintecatro horas despois da estimulación, as células T transducironse con lentivirus (10 μl de sobrenadante de virus concentrado por 10⁶ células). De 1 a 3 días despois da transdución en Cytek Aurora (en FSC (dispersión directa)/SSC (dispersión lateral), singlete, GFP+), avaliar a expresión de GFP das células para demostrar unha eficiencia de transdución de polo menos o 30 %.
As células CAR-T cultiváronse durante 24 horas en Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementado con PenStrep ao 1%) nas seguintes condicións: sen tratar, tratadas con 250 μM de adenosina ou 10 mM de MNA. Despois do pretratamento, as células CAR-T laváronse con PBS e combináronse con 20.000 células SK-OV-3 [ATCC; en medio McCoy 5A (Sigma-Aldrich) suplementado con FBS ao 10% e PenStrep ao 1% a 10: A proporción efector-diana de 1 amplificouse por triplicado en medio Immunocult suplementado. As células SK-OV-3 e as células SK-OV-3 lisadas con saponina dixital (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) utilizáronse como controis negativos e positivos, respectivamente. Despois de 24 horas de cocultivo, recolleuse o sobrenadante e medíuse a lactato deshidroxenase (LDH) segundo as instrucións do fabricante (kit de ensaio de citotoxicidade LDH Glo, Promega). O sobrenadante de LDH diluíuse 1:50 en tampón LDH. A porcentaxe de destrución medíuse usando a seguinte fórmula: porcentaxe de destrución = porcentaxe de corrección / taxa máxima de destrución x 100 %, onde porcentaxe de corrección = cocultivo só con células T e taxa máxima de destrución = control positivo - control negativo.
Como se describe no texto ou nos materiais e métodos, use GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ou R v3.6.0 para a análise estatística. Se se recollen varias mostras do mesmo paciente (como ascite e tumor), empregamos unha proba t pareada ou incluímos o paciente como un efecto aleatorio nun modelo lineal ou xeneralizado segundo corresponda. Para a análise metabolómica, a proba de importancia realízase por triplicado.
Para obter materiais complementarios para este artigo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Este é un artigo de acceso aberto distribuído baixo os termos da licenza Creative Commons Atribución-NonComercial, que permite o uso, a distribución e a reprodución en calquera medio, sempre que o uso final non sexa para beneficio comercial e a premisa sexa que a obra orixinal sexa correcta. Referencia.
Nota: Só che pedimos que facilites o teu enderezo de correo electrónico para que a persoa que recomendas á páxina saiba que queres que vexa o correo electrónico e que non é spam. Non capturaremos ningún enderezo de correo electrónico.
Esta pregunta úsase para comprobar se es visitante e evitar o envío automático de correo lixo.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Russelell Jones (Brad H. Nelson), Ralph J. De Russels De Russel Jones (Ralph J. Russell), Ralph J. De Bellardinis G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
O MNA contribúe á inmunosupresión das células T e representa unha posible diana de inmunoterapia para o tratamento do cancro humano.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Russelell Jones (Brad H. Nelson), Ralph J. De Russels De Russel Jones (Ralph J. Russell), Ralph J. De Bellardinis G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
O MNA contribúe á inmunosupresión das células T e representa unha posible diana de inmunoterapia para o tratamento do cancro humano.
©2021 Asociación Americana para o Avance da Ciencia. todos os dereitos reservados. AAAS é socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.