Demostrouse que o ácido propiónico (PPA), un axente antifúnxico e aditivo dietético común, causa un neurodesenvolvemento anormal en ratos acompañado de disfunción gastrointestinal, que pode estar causada por disbiose intestinal. Suxeriuse unha relación entre a exposición dietética ao PPA e a disbiose da microbiota intestinal, pero non se investigou directamente. Aquí, investigamos os cambios asociados ao PPA na composición da microbiota intestinal que poden levar á disbiose. Secuenciáronse os microbiomas intestinais de ratos alimentados cunha dieta non tratada (n = 9) e unha dieta enriquecida con PPA (n = 13) mediante secuenciación metaxenómica de longo alcance para avaliar as diferenzas na composición microbiana e as vías metabólicas bacterianas. O PPA dietético asociouse cun aumento na abundancia de taxons significativos, incluíndo varias especies de Bacteroides, Prevotella e Ruminococcus, membros das cales foron implicados previamente na produción de PPA. Os microbiomas dos ratos expostos ao PPA tamén tiñan máis vías relacionadas co metabolismo dos lípidos e a biosíntese de hormonas esteroides. Os nosos resultados indican que o PPA pode alterar a microbiota intestinal e as súas vías metabólicas asociadas. Estes cambios observados salientan que os conservantes clasificados como seguros para o consumo poden influír na composición da microbiota intestinal e, á súa vez, na saúde humana. Entre eles, escóllese P, G ou S dependendo do nivel de clasificación que se estea a analizar. Para minimizar o impacto das clasificacións de falsos positivos, adoptouse un limiar mínimo de abundancia relativa de 1e-4 (1/10.000 lecturas). Antes da análise estatística, as abundancias relativas informadas por Bracken (fraction_total_reads) transformáronse mediante a transformación do índice logarítmico centrado (CLR) (Aitchison, 1982). Escolleuse o método CLR para a transformación de datos porque é invariante na escala e suficiente para conxuntos de datos non dispersos (Gloor et al., 2017). A transformación CLR utiliza o logaritmo natural. Os datos de reconto informados por Bracken normalizáronse mediante a expresión logarítmica relativa (RLE) (Anders e Huber, 2010). As figuras xeráronse mediante unha combinación de matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 e logaritmos secuenciais (Gloor et al., 2017). 0.12.2 e stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). A proporción Bacillus/Bacteroidetes calculouse para cada mostra empregando recontos bacterianos normalizados. Os valores indicados nas táboas redondéanse a 4 decimais. O índice de diversidade de Simpson calculouse empregando o script alpha_diversity.py proporcionado no paquete KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). O informe de Bracken ofrécese no script e o índice de Simpson "Si" ofrécese para o parámetro -an. As diferenzas significativas na abundancia definíronse como diferenzas medias de CLR ≥ 1 ou ≤ -1. Unha diferenza media de CLR de ±1 indica un aumento de 2,7 veces na abundancia dun tipo de mostra. O signo (+/-) indica se o taxon é máis abundante na mostra de PPA e na mostra de control, respectivamente. A significancia determinouse mediante a proba U de Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). Empregouse Statsmodels v. 0.14 (Benjamini e Hochberg, 1995; Seabold e Perktold, 2010) e aplicouse o procedemento de Benjamini-Hochberg para corrixir as probas múltiples. Utilizouse un valor p axustado ≤ 0,05 como limiar para determinar a significancia estatística.
O microbioma humano adoita denominarse "o último órgano do corpo" e desempeña un papel vital na saúde humana (Baquero e Nombela, 2012). En particular, o microbioma intestinal é recoñecido pola súa influencia en todo o sistema e o seu papel en moitas funcións esenciais. As bacterias comensais abundan no intestino, ocupan múltiples nichos ecolóxicos, utilizan nutrientes e compiten con posibles patóxenos (Jandhyala et al., 2015). Diversos compoñentes bacterianos da microbiota intestinal son capaces de producir nutrientes esenciais como vitaminas e promover a dixestión (Rowland et al., 2018). Tamén se demostrou que os metabolitos bacterianos inflúen no desenvolvemento dos tecidos e melloran as vías metabólicas e inmunitarias (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). A composición do microbioma intestinal humano é extremadamente diversa e depende de factores xenéticos e ambientais como a dieta, o sexo, os medicamentos e o estado de saúde (Kumbhare et al., 2019).
A dieta materna é un compoñente fundamental do desenvolvemento fetal e neonatal e unha posible fonte de compostos que poden influír no desenvolvemento (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Un destes compostos de interese é o ácido propiónico (PPA), un subproduto de ácido graxo de cadea curta obtido da fermentación bacteriana e un aditivo alimentario (den Besten et al., 2013). O PPA ten propiedades antibacterianas e antifúnxicas e, polo tanto, utilízase como conservante alimentario e en aplicacións industriais para inhibir o crecemento de mofo e bacterias (Wemmenhove et al., 2016). O PPA ten diferentes efectos en diferentes tecidos. No fígado, o PPA ten efectos antiinflamatorios ao afectar a expresión de citocinas nos macrófagos (Kawasoe et al., 2022). Este efecto regulador tamén se observou noutras células inmunitarias, o que leva á regulación á baixa da inflamación (Haase et al., 2021). Non obstante, observouse o efecto contrario no cerebro. Estudos previos demostraron que a exposición ao PPA induce un comportamento similar ao autismo en ratos (El-Ansary et al., 2012). Outros estudos demostraron que o PPA pode inducir gliose e activar vías proinflamatorias no cerebro (Abdelli et al., 2019). Debido a que o PPA é un ácido débil, pode difundirse a través do epitelio intestinal á corrente sanguínea e, polo tanto, cruzar barreiras restritivas, incluída a barreira hematoencefálica e a placenta (Stinson et al., 2019), o que destaca a importancia do PPA como metabolito regulador producido polas bacterias. Aínda que o posible papel do PPA como factor de risco para o autismo está a ser investigado, os seus efectos en individuos con autismo poden estenderse máis alá da indución da diferenciación neuronal.
Os síntomas gastrointestinais como a diarrea e o estrinximento son frecuentes en pacientes con trastornos do neurodesenvolvemento (Cao et al., 2021). Estudos previos demostraron que o microbioma dos pacientes con trastornos do espectro autista (TEA) difire do dos individuos sans, o que suxire a presenza de disbiose na microbiota intestinal (Finegold et al., 2010). Do mesmo xeito, as características do microbioma dos pacientes con enfermidades inflamatorias intestinais, obesidade, enfermidade de Alzheimer, etc. tamén difiren das dos individuos sans (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Non obstante, ata a data, non se estableceu ningunha relación causal entre o microbioma intestinal e as enfermidades ou síntomas neurolóxicos (Yap et al., 2021), aínda que se cre que varias especies bacterianas desempeñan un papel nalgunhas destas enfermidades. Por exemplo, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio e outros xéneros son máis abundantes na microbiota de pacientes con autismo (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). É importante destacar que se sabe que as especies membros dalgúns destes xéneros posúen xenes asociados coa produción de PPA (Reichardt et al., 2014; Yun e Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur e Dürre, 2023). Dadas as propiedades antimicrobianas do PPA, aumentar a súa abundancia pode ser beneficioso para o crecemento de bacterias produtoras de PPA (Jacobson et al., 2018). Polo tanto, un ambiente rico en PFA pode provocar cambios na microbiota intestinal, incluídos patóxenos gastrointestinais, que poden ser factores potenciais que leven a síntomas gastrointestinais.
Unha cuestión central na investigación do microbioma é se as diferenzas na composición microbiana son unha causa ou un síntoma de enfermidades subxacentes. O primeiro paso para dilucidar a complexa relación entre a dieta, o microbioma intestinal e as enfermidades neurolóxicas é avaliar os efectos da dieta na composición microbiana. Para este fin, empregamos a secuenciación metaxenómica de lectura longa para comparar os microbiomas intestinais da descendencia de ratos alimentados cunha dieta rica en PPA ou con pouca PPA. A descendencia recibiu a mesma dieta que as súas nais. A nosa hipótese é que unha dieta rica en PPA provocaría cambios na composición microbiana intestinal e nas vías funcionais microbianas, especialmente as relacionadas co metabolismo do PPA e/ou a produción de PPA.
Este estudo empregou ratos transxénicos FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) que sobreexpresan a proteína verde fluorescente (GFP) baixo o control do promotor GFAP específico da glía, seguindo as directrices do Comité Institucional de Coidado e Uso de Animais da Universidade de Florida Central (UCF-IACUC) (Número de permiso de uso de animais: PROTO202000002). Despois do destete, os ratos aloxáronse individualmente en gaiolas con 1 a 5 ratos de cada sexo por gaiola. Os ratos alimentáronse ad libitum cunha dieta de control purificada (dieta estándar de etiqueta aberta modificada, 16 kcal % de graxa) ou unha dieta suplementada con propionato de sodio (dieta estándar de etiqueta aberta modificada, 16 kcal % de graxa, que contén 5.000 ppm de propionato de sodio). A cantidade de propionato de sodio utilizada foi equivalente a 5.000 mg de PFA/kg de peso total do alimento. Esta é a concentración máis alta de PPA aprobada para o seu uso como conservante alimentario. Para prepararse para este estudo, os ratos proxenitores recibiron ambas as dietas durante 4 semanas antes do apareamento e continuaron durante toda a xestación da nai. Os ratos fillos [22 ratos, 9 controis (6 machos, 3 femias) e 13 PPA (4 machos, 9 femias)] foron destetados e logo continuaron coa mesma dieta que as nais durante 5 meses. Os ratos fillos foron sacrificados aos 5 meses de idade e os seus contidos fecais intestinales recolleronse e almacenáronse inicialmente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 °C e logo transferíronse a un conxelador a -80 °C ata que se esgotou o ADN do hóspede e se extraeron os ácidos nucleicos microbianos.
O ADN do hóspede eliminouse segundo un protocolo modificado (Charalampous et al., 2019). En resumo, o contido fecal transferiuse a 500 µl de InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) e almacenouse conxelado. Procesar un máximo de 1-2 gránulos fecais por extracción. O contido fecal homoxenizouse mecanicamente cun manolo de plástico dentro do tubo para formar unha suspensión. Centrifugar as mostras a 10.000 RCF durante 5 minutos ou ata que as mostras se sedimenten, despois aspirar o sobrenadante e resuspender o gránulo en 250 µl de 1× PBS. Engadir 250 µl de solución de saponina ao 4,4 % (TCI, número de produto S0019) á mostra como deterxente para afrouxar as membranas das células eucariotas. As mostras mesturáronse suavemente ata que quedaron homoxéneas e incubáronse a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, para romper as células eucariotas, engadíronse 350 μl de auga libre de nucleases á mostra, incubouse durante 30 segundos e, a continuación, engadíronse 12 μl de NaCl 5 M. As mostras centrifugáronse a 6000 RCF durante 5 minutos. Aspirar o sobrenadante e resuspender o precipitado en 100 μl de PBS 1X. Para eliminar o ADN do hóspede, engadir 100 μl de tampón HL-SAN (12,8568 g de NaCl, 4 ml de MgCl2 1M, 36 ml de auga libre de nucleases) e 10 μl de encima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). As mostras mesturáronse completamente mediante pipeteo e incubáronse a 37 °C durante 30 minutos a 800 rpm nun Eppendorf™ ThermoMixer C. Despois da incubación, centrifugáronse a 6000 RCF durante 3 minutos e laváronse dúas veces con 800 µl e 1000 µl de PBS 1X. Finalmente, resuspendéuse o precipitado en 100 µl de PBS 1X.
O ADN bacteriano total illouse empregando o kit de purificación de ADN xenómico Monarch de New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, n.º de cat. T3010L). O procedemento operativo estándar proporcionado co kit está lixeiramente modificado. Incubar e manter auga libre de nucleases a 60 °C antes da operación para a elución final. Engadir 10 µl de proteinase K e 3 µl de RNase A a cada mostra. Despois, engadir 100 µl de tampón de lise celular e mesturar suavemente. Despois, as mostras incubáronse nun Eppendorf™ ThermoMixer C a 56 °C e 1400 rpm durante polo menos 1 hora e ata 3 horas. As mostras incubadas centrifugáronse a 12 000 RCF durante 3 minutos e o sobrenadante de cada mostra transferiuse a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL separado que contiña 400 µL de solución de unión. Despois, os tubos axitáronse en vórtice por pulsos durante 5-10 segundos a intervalos de 1 segundo. Transferir todo o contido líquido de cada mostra (aproximadamente 600–700 µL) a un cartucho de filtro colocado nun tubo de recollida de fluxo continuo. Os tubos centrifugáronse a 1000 RCF durante 3 minutos para permitir a unión inicial do ADN e despois centrifugáronse a 12 000 RCF durante 1 minuto para eliminar o líquido residual. A columna de mostra transferiuse a un novo tubo de recollida e despois lavouse dúas veces. Para o primeiro lavado, engadir 500 µL de tampón de lavado a cada tubo. Inverter o tubo de 3 a 5 veces e despois centrifugar a 12 000 RCF durante 1 minuto. Desbotar o líquido do tubo de recollida e colocar o cartucho de filtro de volta no mesmo tubo de recollida. Para o segundo lavado, engadir 500 µL de tampón de lavado ao filtro sen inverter. As mostras centrifugáronse a 12 000 RCF durante 1 minuto. Transfira o filtro a un tubo LoBind® de 1,5 mL e engada 100 µL de auga prequentada sen nucleases. Os filtros incubáronse a temperatura ambiente durante 1 minuto e despois centrifugáronse a 12 000 RCF durante 1 minuto. O ADN eluído almacenouse a -80 °C.
A concentración de ADN cuantificouse cun fluorómetro Qubit™ 4.0. O ADN preparouse usando o kit de alta sensibilidade Qubit™ 1X dsDNA (n.º de cat. Q33231) segundo as instrucións do fabricante. A distribución da lonxitude dos fragmentos de ADN mediuse usando unha TapeStation Aglient™ 4150 ou 4200. O ADN preparouse usando os reactivos de ADN xenómico Agilent™ (n.º de cat. 5067-5366) e a cinta Genomic DNA ScreenTape (n.º de cat. 5067-5365). A preparación da biblioteca realizouse usando o kit de código de barras Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding (SQK-RPB004) segundo as instrucións do fabricante. O ADN secuenciouse usando un secuenciador ONT GridION™ Mk1 cunha cela de fluxo Min106D (R 9.4.1). Os axustes de secuenciación foron: chamada de bases de alta precisión, valor q mínimo de 9, configuración do código de barras e recorte do código de barras. As mostras foron secuenciadas durante 72 horas, tras o cal os datos das chamadas de bases foron enviados para o seu posterior procesamento e análise.
O procesamento bioinformático realizouse empregando métodos descritos previamente (Greenman et al., 2024). Os ficheiros FASTQ obtidos da secuenciación dividíronse en directorios para cada mostra. Antes da análise bioinformática, os datos procesáronse empregando a seguinte canle: primeiro, os ficheiros FASTQ das mostras fusionáronse nun único ficheiro FASTQ. Despois, as lecturas de menos de 1000 bp filtráronse empregando Filtlong v. 0.2.1, sendo o único parámetro modificado –min_length 1000 (Wick, 2024). Antes dun filtrado posterior, a calidade da lectura controlouse empregando NanoPlot v. 1.41.3 cos seguintes parámetros: –fastq –plots dot –N50 -o
Para a clasificación taxonómica, as lecturas e os contigs ensamblados clasificáronse usando Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Xerar informes e ficheiros de saída para lecturas e ensamblaxes, respectivamente. Usar a opción –use-names para analizar lecturas e ensamblaxes. As opcións –gzip-compressed e –paired especifícanse para os segmentos de lectura. A abundancia relativa de taxons nos metaxenomas estimouse usando Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Primeiro creamos unha base de datos kmer que contiña 1000 bases usando bracken-build cos seguintes parámetros: -d
A anotación xénica e a estimación da abundancia relativa realizáronse empregando unha versión modificada do protocolo descrito por Maranga et al. (Maranga et al., 2023). En primeiro lugar, os contigs de menos de 500 pb elimináronse de todos os ensamblaxes empregando SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Os ensamblaxes seleccionados combináronse despois nun pan-metaxenoma. Os marcos de lectura abertos (ORF) identificáronse empregando Prodigal v. 1.0.1 (unha versión paralela de Prodigal v. 2.6.3) cos seguintes parámetros: -d
Os xenes agrupáronse primeiro segundo os identificadores ortólogos (KO) da Enciclopedia de Xenes e Xenomas de Quioto (KEGG) asignados por eggNOG para comparar as abundancias das vías xénicas. Os xenes sen knockouts ou os xenes con múltiples knockouts elimináronse antes da análise. A continuación, calculouse a abundancia media de cada KO por mostra e realizouse unha análise estatística. Os xenes do metabolismo do PPA definíronse como calquera xene ao que se lle asignase unha fila ko00640 na columna KEGG_Pathway, o que indica un papel no metabolismo do propionato segundo KEGG. Os xenes identificados como asociados coa produción de PPA aparecen na Táboa Suplementaria 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Realizáronse probas de permutación para identificar os xenes do metabolismo e a produción de PPA que eran significativamente máis abundantes en cada tipo de mostra. Realizáronse mil permutacións para cada xene analizado. Utilizouse un valor p de 0,05 como límite para determinar a significación estatística. As anotacións funcionais asignáronse a xenes individuais dentro dun clúster en función das anotacións de xenes representativos dentro do clúster. Os taxons asociados co metabolismo do PPA e/ou a produción de PPA puidéronse identificar facendo coincidir os ID de contig nos ficheiros de saída de Kraken2 cos mesmos ID de contig retidos durante a anotación funcional usando egNOG. As probas de significancia realizáronse usando a proba U de Mann-Whitney descrita anteriormente. A corrección para probas múltiples realizouse usando o procedemento de Benjamini-Hochberg. Utilizouse un valor p de ≤ 0,05 como límite para determinar a significancia estatística.
A diversidade do microbioma intestinal dos ratos avaliouse mediante o índice de diversidade de Simpson. Non se observaron diferenzas significativas entre as mostras de control e as de PPA en termos de diversidade de xénero e especie (valor p para o xénero: 0,18, valor p para a especie: 0,16) (Figura 1). A continuación, comparouse a composición microbiana mediante a análise de compoñentes principais (PCA). A Figura 2 mostra a agrupación de mostras polos seus filos, o que indica que houbo diferenzas na composición de especies dos microbiomas entre as mostras de PPA e as de control. Esta agrupación foi menos pronunciada a nivel de xénero, o que suxire que o PPA afecta a certas bacterias (Figura suplementaria 1).
Figura 1. Diversidade alfa de xéneros e composición de especies do microbioma intestinal do rato. Diagramas de caixa que mostran os índices de diversidade de Simpson de xéneros (A) e especies (B) en mostras de PPA e control. A significancia determinouse mediante a proba U de Mann-Whitney e realizouse unha corrección múltiple mediante o procedemento de Benjamini-Hochberg. ns, o valor p non foi significativo (p>0,05).
Figura 2. Resultados da análise de compoñentes principais da composición do microbioma intestinal do rato a nivel de especie. A gráfica da análise de compoñentes principais mostra a distribución das mostras nos seus dous primeiros compoñentes principais. As cores indican o tipo de mostra: os ratos expostos ao PPA son de cor púrpura e os ratos de control son amarelos. Os compoñentes principais 1 e 2 represéntanse no eixe x e no eixe y, respectivamente, e exprésanse como a súa razón de varianza explicada.
Usando os datos de reconto transformados por RLE, observouse unha diminución significativa na proporción media de Bacteroidetes/bacilos nos ratos de control e nos ratos PPA (control: 9,66, PPA: 3,02; valor p = 0,0011). Esta diferenza debeuse a unha maior abundancia de Bacteroidetes nos ratos PPA en comparación cos controis, aínda que a diferenza non foi significativa (CLR media do control: 5,51, CLR media do PPA: 6,62; valor p = 0,054), mentres que a abundancia de Bacteroidetes foi similar (CLR media do control: 7,76, CLR media do PPA: 7,60; valor p = 0,18).
A análise da abundancia dos membros taxonómicos do microbioma intestinal revelou que 1 filo e 77 especies difiren significativamente entre as mostras de PPA e as de control (Táboa suplementaria 2). A abundancia de 59 especies nas mostras de PPA foi significativamente maior que a das mostras de control, mentres que a abundancia de só 16 especies nas mostras de control foi maior que a das mostras de PPA (Figura 3).
Figura 3. Abundancia diferencial de taxons no microbioma intestinal de ratos PPA e de control. Os gráficos de volcán mostran diferenzas na abundancia de xéneros (A) ou especies (B) entre as mostras de PPA e de control. Os puntos grises indican que non hai diferenzas significativas na abundancia de taxons. Os puntos de cores indican diferenzas significativas na abundancia (valor p ≤ 0,05). Os 20 principais taxons coas maiores diferenzas de abundancia entre os tipos de mostra móstranse en vermello e azul claro (mostras de control e de PPA), respectivamente. Os puntos amarelos e morados foron polo menos 2,7 veces máis abundantes nas mostras de control ou de PPA que nas controis. Os puntos negros representan taxons con abundancias significativamente diferentes, con diferenzas medias de CLR entre -1 e 1. Os valores de P calculáronse mediante a proba U de Mann-Whitney e corrixíronse para probas múltiples mediante o procedemento de Benjamini-Hochberg. As diferenzas medias de CLR en negra indican diferenzas significativas na abundancia.
Despois de analizar a composición microbiana intestinal, realizamos unha anotación funcional do microbioma. Tras filtrar os xenes de baixa calidade, identificáronse un total de 378.355 xenes únicos en todas as mostras. A abundancia transformada destes xenes utilizouse para a análise de compoñentes principais (PCA) e os resultados mostraron un alto grao de agrupamento dos tipos de mostras en función dos seus perfís funcionais (Figura 4).
Figura 4. Resultados do PCA usando o perfil funcional do microbioma intestinal do rato. O gráfico do PCA mostra a distribución das mostras nos seus dous primeiros compoñentes principais. As cores indican o tipo de mostra: os ratos expostos ao PPA son de cor púrpura e os ratos de control son amarelos. Os compoñentes principais 1 e 2 represéntanse no eixe x e no eixe y, respectivamente, e exprésanse como a súa razón de varianza explicada.
A continuación, examinamos a abundancia de knockouts KEGG en diferentes tipos de mostras. Identificáronse un total de 3648 knockouts únicos, dos cales 196 eran significativamente máis abundantes nas mostras de control e 106 eran máis abundantes nas mostras de PPA (Figura 5). Detectáronse un total de 145 xenes nas mostras de control e 61 xenes nas mostras de PPA, con abundancias significativamente diferentes. As vías relacionadas co metabolismo dos lípidos e dos aminoazucres estaban significativamente máis enriquecidas nas mostras de PPA (Táboa suplementaria 3). As vías relacionadas co metabolismo do nitróxeno e os sistemas de retransmisión do xofre estaban significativamente máis enriquecidas nas mostras de control (Táboa suplementaria 3). A abundancia de xenes relacionados co metabolismo dos aminoazucres/nucleótidos (ko:K21279) e o metabolismo do fosfato de inositol (ko:K07291) foi significativamente maior nas mostras de PPA (Figura 5). As mostras de control tiñan significativamente máis xenes relacionados co metabolismo do benzoato (ko:K22270), o metabolismo do nitróxeno (ko:K00368) e a glicólise/gluconeoxénese (ko:K00131) (Figura 5).
Fig. 5. Abundancia diferencial de KOs no microbioma intestinal de ratos PPA e control. O gráfico do volcán representa as diferenzas na abundancia de grupos funcionais (KOs). Os puntos grises indican KOs cuxa abundancia non foi significativamente diferente entre os tipos de mostra (valor p > 0,05). Os puntos de cores indican diferenzas significativas na abundancia (valor p ≤ 0,05). Os 20 KOs coas maiores diferenzas en abundancia entre os tipos de mostra móstranse en vermello e azul claro, correspondentes ás mostras de control e PPA, respectivamente. Os puntos amarelos e morados indican KOs que foron polo menos 2,7 veces máis abundantes nas mostras de control e PPA, respectivamente. Os puntos negros indican KOs con abundancias significativamente diferentes, con diferenzas medias de CLR entre -1 e 1. Os valores P calculáronse mediante a proba U de Mann-Whitney e axustáronse para comparacións múltiples mediante o procedemento de Benjamini-Hochberg. NaN indica que o KO non pertence a unha vía en KEGG. Os valores medios de diferenza de CLR en negra indican diferenzas significativas na abundancia. Para obter información detallada sobre as vías ás que pertencen os KO listados, consulte a Táboa suplementaria 3.
Entre os xenes anotados, 1601 xenes tiveron abundancias significativamente diferentes entre os tipos de mostra (p ≤ 0,05), sendo cada xene polo menos 2,7 veces máis abundante. Destes xenes, 4 xenes foron máis abundantes nas mostras de control e 1597 xenes foron máis abundantes nas mostras de PPA. Debido a que o PPA ten propiedades antimicrobianas, examinamos as abundancias dos xenes do metabolismo e da produción de PPA entre os tipos de mostra. Entre os 1332 xenes relacionados co metabolismo do PPA, 27 xenes foron significativamente máis abundantes nas mostras de control e 12 xenes foron máis abundantes nas mostras de PPA. Entre os 223 xenes relacionados coa produción de PPA, 1 xene foi significativamente máis abundante nas mostras de PPA. A Figura 6A demostra aínda máis a maior abundancia de xenes implicados no metabolismo do PPA, cunha abundancia significativamente maior nas mostras de control e grandes tamaños de efecto, mentres que a Figura 6B destaca xenes individuais cunha abundancia significativamente maior observada nas mostras de PPA.
Fig. 6. Abundancia diferencial de xenes relacionados co PPA no microbioma intestinal do rato. Os gráficos de volcán representan as diferenzas na abundancia de xenes asociados co metabolismo do PPA (A) e a produción de PPA (B). Os puntos grises indican xenes cuxa abundancia non foi significativamente diferente entre os tipos de mostra (valor p > 0,05). Os puntos de cores indican diferenzas significativas na abundancia (valor p ≤ 0,05). Os 20 xenes coas maiores diferenzas na abundancia móstranse en vermello e azul claro (mostras de control e de PPA), respectivamente. A abundancia de puntos amarelos e morados foi polo menos 2,7 veces maior nas mostras de control e de PPA que nas mostras de control. Os puntos negros representan xenes con abundancias significativamente diferentes, con diferenzas medias de CLR entre -1 e 1. Os valores de P calculáronse mediante a proba U de Mann-Whitney e corrixíronse para comparacións múltiples mediante o procedemento de Benjamini-Hochberg. Os xenes corresponden a xenes representativos no catálogo de xenes non redundantes. Os nomes dos xenes consisten no símbolo KEGG que denota un xene KO. As diferenzas medias de CLR en negra indican abundancias significativamente diferentes. Un guión (-) indica que non existe ningún símbolo para o xene na base de datos KEGG.
Os taxons con xenes relacionados co metabolismo e/ou a produción de PPA identificáronse facendo coincidir a identidade taxonómica dos contigs co ID de contig do xene. A nivel de xénero, atopáronse 130 xéneros con xenes relacionados co metabolismo do PPA e 61 xéneros con xenes relacionados coa produción de PPA (Táboa suplementaria 4). Non obstante, ningún xénero mostrou diferenzas significativas na abundancia (p > 0,05).
A nivel de especie, atopáronse 144 especies bacterianas con xenes asociados co metabolismo do PPA e 68 especies bacterianas con xenes asociados coa produción de PPA (Táboa suplementaria 5). Entre os metabolizadores de PPA, oito bacterias mostraron aumentos significativos na abundancia entre os tipos de mostra e todas mostraron cambios significativos no efecto (Táboa suplementaria 6). Todos os metabolizadores de PPA identificados con diferenzas significativas na abundancia foron máis abundantes nas mostras de PPA. A clasificación a nivel de especie revelou representantes de xéneros que non difiren significativamente entre os tipos de mostra, incluíndo varias especies de Bacteroides e Ruminococcus, así como Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus e Alcaligenes polymorpha. Entre as bacterias produtoras de PPA, catro bacterias mostraron diferenzas significativas na abundancia entre os tipos de mostra. As especies con diferenzas significativas na abundancia incluíron Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis e Ruminococcus bovis.
Neste estudo, examinamos os efectos da exposición ao PPA na microbiota intestinal de ratos. O PPA pode provocar diferentes respostas nas bacterias porque é producido por certas especies, utilizado como fonte de alimento por outras especies ou ten efectos antimicrobianos. Polo tanto, a súa adición ao ambiente intestinal a través da suplementación dietética pode ter diferentes efectos dependendo da tolerancia, a susceptibilidade e a capacidade de utilizalo como fonte de nutrientes. As especies bacterianas sensibles poden ser eliminadas e substituídas por aquelas que son máis resistentes ao PPA ou capaces de utilizalo como fonte de alimento, o que leva a cambios na composición da microbiota intestinal. Os nosos resultados revelaron diferenzas significativas na composición microbiana, pero ningún efecto na diversidade microbiana xeral. Os maiores efectos observáronse a nivel de especie, con máis de 70 taxons significativamente diferentes en abundancia entre as mostras de PPA e de control (Táboa suplementaria 2). Unha avaliación posterior da composición das mostras expostas ao PPA revelou unha maior heteroxeneidade das especies microbianas en comparación coas mostras non expostas, o que suxire que o PPA pode mellorar as características de crecemento bacteriano e limitar as poboacións bacterianas que poden sobrevivir en ambientes ricos en PPA. Polo tanto, o PPA pode inducir cambios selectivamente en lugar de causar unha alteración xeneralizada da diversidade da microbiota intestinal.
Xa se demostrou previamente que os conservantes alimentarios como o PPA alteran a abundancia dos compoñentes do microbioma intestinal sen afectar a diversidade xeral (Nagpal et al., 2021). Aquí, observamos as diferenzas máis rechamantes entre as especies de Bacteroidetes dentro do filo Bacteroidetes (anteriormente coñecido como Bacteroidetes), que estaban significativamente enriquecidas en ratos expostos ao PPA. Unha maior abundancia de especies de Bacteroides está asociada a unha maior degradación do moco, o que pode aumentar o risco de infección e promover a inflamación (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Un estudo descubriu que os ratos machos neonatos tratados con Bacteroides fragilis exhibían comportamentos sociais que lembran o trastorno do espectro autista (TEA) (Carmel et al., 2023), e outros estudos demostraron que as especies de Bacteroides poden alterar a actividade inmunitaria e levar á cardiomiopatía inflamatoria autoinmune (Gil-Cruz et al., 2019). As especies pertencentes aos xéneros Ruminococcus, Prevotella e Parabacteroides tamén aumentaron significativamente en ratos expostos a PPA (Coretti et al., 2018). Certas especies de Ruminococcus están asociadas con enfermidades como a enfermidade de Crohn a través da produción de citocinas proinflamatorias (Henke et al., 2019), mentres que as especies de Prevotella, como Prevotella humani, están asociadas con enfermidades metabólicas como a hipertensión e a sensibilidade á insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Finalmente, descubrimos que a proporción de Bacteroidetes (anteriormente coñecidos como Firmicutes) con respecto a Bacteroidetes era significativamente menor en ratos expostos a PPA que en ratos de control debido a unha maior abundancia total de especies de Bacteroidetes. Anteriormente demostrouse que esta proporción é un indicador importante da homeostase intestinal, e as alteracións nesta proporción asociáronse con varios estados de enfermidade (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), incluídas as enfermidades inflamatorias intestinais (Stojanov et al., 2020). Conxuntamente, as especies do filo Bacteroidetes parecen verse máis afectadas por un PPA elevado na dieta. Isto pode deberse a unha maior tolerancia ao PPA ou á capacidade de utilizar o PPA como fonte de enerxía, o que se demostrou que é certo para polo menos unha especie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativamente, a exposición materna ao PPA pode mellorar o desenvolvemento fetal ao facer que o intestino das crías de rato sexa máis susceptible á colonización por Bacteroidetes; non obstante, o deseño do noso estudo non permitiu tal avaliación.
A avaliación do contido metaxenómico revelou diferenzas significativas na abundancia de xenes asociados co metabolismo e a produción de PPA, cos ratos expostos ao PPA que mostraron unha maior abundancia de xenes responsables da produción de PPA, mentres que os ratos non expostos ao PPA mostraron unha maior abundancia de xenes responsables do metabolismo do PAA (Figura 6). Estes resultados suxiren que o efecto do PPA na composición microbiana pode non deberse unicamente ao seu uso; se non, a abundancia de xenes asociados co metabolismo do PPA debería ter mostrado unha maior abundancia no microbioma intestinal dos ratos expostos ao PPA. Unha explicación é que o PPA media a abundancia bacteriana principalmente a través dos seus efectos antimicrobianos en lugar de a través do seu uso por parte das bacterias como nutriente. Estudos previos demostraron que o PPA inhibe o crecemento de Salmonella Typhimurium dun xeito dependente da dose (Jacobson et al., 2018). A exposición a concentracións máis altas de PPA pode seleccionar bacterias que son resistentes ás súas propiedades antimicrobianas e que poden non ser necesariamente capaces de metabolizalo ou producilo. Por exemplo, varias especies de *Parabacteroides* mostraron unha abundancia significativamente maior en mostras de PPA, pero non se detectaron xenes relacionados co metabolismo ou a produción de PPA (táboas suplementarias 2, 4 e 5). Ademais, a produción de PPA como subproduto da fermentación está amplamente distribuída entre diversas bacterias (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Unha maior diversidade bacteriana pode ser a razón da maior abundancia de xenes relacionados co metabolismo do PPA nas mostras de control (Averina et al., 2020). Ademais, só se predixo que 27 (2,14 %) dos 1332 xenes eran xenes asociados exclusivamente co metabolismo do PPA. Moitos xenes asociados co metabolismo do PPA tamén están implicados noutras vías metabólicas. Isto demostra aínda máis que a abundancia de xenes implicados no metabolismo do PPA foi maior nas mostras de control; estes xenes poden funcionar en vías que non resultan na utilización ou formación de PPA como subproduto. Neste caso, só un xene asociado coa xeración de PPA mostrou diferenzas significativas na abundancia entre os tipos de mostra. En contraste cos xenes asociados co metabolismo do PPA, seleccionáronse xenes marcadores para a produción de PPA porque están directamente implicados na vía bacteriana para a produción de PPA. En ratos expostos ao PPA, atopouse que todas as especies tiñan unha abundancia e unha capacidade significativamente maiores para producir PPA. Isto apoia a predición de que os PPA seleccionarían produtores de PPA e, polo tanto, predín que a capacidade de produción de PPA aumentaría. Non obstante, a abundancia de xenes non se correlaciona necesariamente coa expresión xénica; polo tanto, aínda que a abundancia de xenes asociados co metabolismo do PPA é maior nas mostras de control, a taxa de expresión pode ser diferente (Shi et al., 2014). Para confirmar a relación entre a prevalencia de xenes produtores de PPA e a produción de PPA, son necesarios estudos da expresión dos xenes implicados na produción de PPA.
A anotación funcional dos metaxenomas de PPA e de control revelou algunhas diferenzas. A análise PCA do contido xénico revelou clústeres discretos entre as mostras de PPA e de control (Figura 5). A agrupación dentro da mostra revelou que o contido xénico de control era máis diverso, mentres que as mostras de PPA agrupábanse xuntas. A agrupación por contido xénico foi comparable á agrupación por composición de especies. Polo tanto, as diferenzas na abundancia das vías xenéticas son consistentes cos cambios na abundancia de especies e cepas específicas dentro delas. Nas mostras de PPA, dúas vías con abundancia significativamente maior estaban relacionadas co metabolismo de aminoazucres/nucleótidos (ko:K21279) e con múltiples vías do metabolismo lipídico (ko:K00647, ko:K03801; Táboa suplementaria 3). Sábese que os xenes asociados con ko:K21279 están asociados co xénero Bacteroides, un dos xéneros cun número significativamente maior de especies nas mostras de PPA. Este encima pode evadir a resposta inmunitaria expresando polisacáridos capsulares (Wang et al., 2008). Isto pode explicar o aumento de Bacteroidetes observado en ratos expostos ao PPA. Isto complementa o aumento da síntese de ácidos graxos observado no microbioma do PPA. As bacterias utilizan a vía FASIIko:K00647 (fabB) para producir ácidos graxos, que poden influír nas vías metabólicas do hóspede (Yao e Rock, 2015; Johnson et al., 2020), e os cambios no metabolismo dos lípidos poden desempeñar un papel no neurodesenvolvemento (Yu et al., 2020). Outra vía que mostrou unha maior abundancia nas mostras de PPA foi a biosíntese de hormonas esteroides (ko:K12343). Existen cada vez máis evidencias de que existe unha relación inversa entre a capacidade da microbiota intestinal para influír nos niveis hormonais e para ser influenciada por estas, de tal xeito que os niveis elevados de esteroides poden ter consecuencias para a saúde posteriores (Tetel et al., 2018).
Este estudo non está exento de limitacións e consideracións. Unha distinción importante é que non realizamos avaliacións fisiolóxicas dos animais. Polo tanto, non é posible concluír directamente se os cambios no microbioma están asociados con algunha enfermidade. Outra consideración é que os ratos deste estudo recibiron a mesma dieta que as súas nais. Os estudos futuros poden determinar se o cambio dunha dieta rica en PPA a unha dieta libre de PPA mellora os seus efectos no microbioma. Unha limitación do noso estudo, como de moitos outros, é o tamaño limitado da mostra. Aínda que se poden extraer conclusións válidas, un tamaño de mostra maior proporcionaría unha maior potencia estatística á hora de analizar os resultados. Tamén somos cautelosos á hora de extraer conclusións sobre unha asociación entre os cambios no microbioma intestinal e calquera enfermidade (Yap et al., 2021). Os factores de confusión, como a idade, o sexo e a dieta, poden influír significativamente na composición dos microorganismos. Estes factores poden explicar as inconsistencias observadas na literatura con respecto á asociación do microbioma intestinal con enfermidades complexas (Johnson et al., 2019; Lagod e Naser, 2023). Por exemplo, demostrouse que os membros do xénero Bacteroidetes aumentan ou diminuen en animais e humanos con TEA (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Do mesmo xeito, estudos sobre a composición intestinal en pacientes con enfermidades inflamatorias intestinais atoparon tanto aumentos como diminucións nos mesmos taxons (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Para limitar o impacto do nesgo de xénero, tentamos garantir unha representación equitativa dos sexos para que as diferenzas probablemente estivesen impulsadas pola dieta. Un desafío da anotación funcional é a eliminación de secuencias xénicas redundantes. O noso método de agrupamento xénico require un 95 % de identidade de secuencia e un 85 % de similitude de lonxitude, así como unha cobertura de aliñamento do 90 % para eliminar a falsa agrupación. Non obstante, nalgúns casos, observamos COG coas mesmas anotacións (por exemplo, MUT) (Fig. 6). Necesítanse máis estudos para determinar se estes ortólogos son distintos, se están asociados a xéneros específicos ou se isto é unha limitación da abordaxe de agrupamento de xenes. Outra limitación da anotación funcional é a posible clasificación errónea; o xene bacteriano mmdA é un encima coñecido que participa na síntese de propionato, pero KEGG non o asocia coa vía metabólica do propionato. Pola contra, os ortólogos scpB e mmcD están relacionados. O gran número de xenes sen knockouts designados pode resultar nunha incapacidade para identificar xenes relacionados co PPA ao avaliar a abundancia de xenes. Os estudos futuros beneficiaranse da análise de metatranscriptomas, que pode proporcionar unha comprensión máis profunda das características funcionais da microbiota intestinal e vincular a expresión xénica con posibles efectos posteriores. Para estudos que impliquen trastornos neurodesenvolvemento específicos ou enfermidades inflamatorias intestinais, necesítanse avaliacións fisiolóxicas e de comportamento dos animais para vincular os cambios na composición do microbioma con estes trastornos. Estudos adicionais que transplanten o microbioma intestinal a ratos libres de xermes tamén serían útiles para determinar se o microbioma é un impulsor ou unha característica da enfermidade.
En resumo, demostramos que o PPA da dieta actúa como un factor que altera a composición da microbiota intestinal. O PPA é un conservante aprobado pola FDA que se atopa amplamente en varios alimentos e que, tras unha exposición a longo prazo, pode provocar a alteración da flora intestinal normal. Atopamos cambios na abundancia de varias bacterias, o que suxire que o PPA pode influír na composición da microbiota intestinal. Os cambios na microbiota poden provocar cambios nos niveis de certas vías metabólicas, o que pode levar a cambios fisiolóxicos relevantes para a saúde do hóspede. Necesítanse máis estudos para determinar se os efectos do PPA da dieta na composición microbiana poden provocar disbiose ou outras enfermidades. Este estudo senta as bases para futuros estudos sobre como os efectos do PPA na composición intestinal poden afectar á saúde humana.
Os conxuntos de datos presentados neste estudo están dispoñibles en repositorios en liña. O nome do repositorio e o número de acceso son: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Este estudo con animais foi aprobado polo Comité Institucional de Coidado e Uso de Animais da Universidade de Florida Central (UCF-IACUC) (Número de permiso de uso de animais: PROTO202000002). Este estudo cumpre coas leis, regulamentos e requisitos institucionais locais.
NG: Conceptualización, curación de datos, análise formal, investigación, metodoloxía, software, visualización, redacción (borrador orixinal), redacción (revisión e edición). LA: Conceptualización, curación de datos, metodoloxía, recursos, redacción (revisión e edición). SH: Análise formal, software, redacción (revisión e edición). SA: Investigación, redacción (revisión e edición). Xuíz xefe: Investigación, redacción (revisión e edición). SN: Conceptualización, administración de proxectos, recursos, supervisión, redacción (revisión e edición). TA: Conceptualización, administración de proxectos, supervisión, redacción (revisión e edición).
Os autores declaran que non recibiron apoio financeiro para a investigación, autoría e/ou publicación deste artigo.
Os autores declaran que a investigación se realizou en ausencia de calquera relación comercial ou financeira que poida interpretarse como un posible conflito de intereses. Non aplicable.
Todas as opinións expresadas neste artigo son exclusivamente as dos autores e non reflicten necesariamente os puntos de vista das súas institucións, editores, editores ou revisores. Os produtos avaliados neste artigo, ou as afirmacións feitas polos seus fabricantes, non están garantidos nin avalados polo editor.
Pódese atopar material complementario para este artigo en liña: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). O ácido propiónico induce gliose e neuroinflamación ao regular a vía PTEN/AKT nos trastornos do espectro autista. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Análise estatística de datos de composición. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Proporción Firmicutes/Bacteroidetes como factor de risco para o cancro de mama. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Análise de expresión diferencial de datos de reconto de secuencias. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Microbiota fecal e metaboloma en nenos con autismo e trastorno xeneralizado do desenvolvemento non especificado doutro xeito. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Características neurometabólicas bacterianas da microbiota intestinal en nenos pequenos con trastornos do espectro autista. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). O microbioma como órgano humano. *Clinical Microbiology and Infection* 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Novas perspectivas sobre a fisioloxía das bacterias produtoras de ácido propiónico: Anaerotignum propionicum e Anaerotignum neopropionicum (anteriormente Clostridium propionicum e Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Nutrición materna e desenvolvemento fetal. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. e Hochberg, J. (1995). Control da taxa de falsos positivos: unha estratexia práctica e eficiente para realizar probas múltiples. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Data de publicación: 18 de abril de 2025