Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, mostraremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
A diferenza dos vertebrados, pénsase amplamente que os insectos carecen de hormonas esteroides sexuais con sesgo masculino. En *Anopheles gambiae*, o esteroide ecdisona 20-hidroxiecdisona (20E) parece ter evolucionado para controlar o desenvolvemento dos ovos cando son sintetizados polas femias2 e para inducir un período refractario de apareamento cando son transferidos sexualmente polos machos3. Dado que o desenvolvemento e o apareamento dos ovos son trazos reprodutivos esenciais, comprender como as femias do mosquito *Anopheles* integran estes sinais hormonais podería facilitar o deseño de novos programas de control da malaria. Aquí, revelamos que estas funcións reprodutivas están reguladas por distintos esteroides sexuais a través dunha complexa rede de encimas activadores/inactivadores de ecdisteroides. Identificamos unha ecdisona oxidada específica do macho, a 3-deshidro-20E (3D20E), que protexe a paternidade ao pechar a receptividade sexual das femias despois da transferencia sexual e a activación por desfosforilación. Cabe destacar que a transferencia de 3D20E tamén induciu a expresión de xenes reprodutivos que manteñen o desenvolvemento dos ovos durante a infección por Plasmodium, garantindo a saúde das femias infectadas. A 20E derivada das femias non provoca un período sexual resposta, pero permite que os individuos en proceso de apareamento poñan ovos despois de inhibir as quinases inhibidoras de 20E. A identificación desta hormona esteroide de insectos específica do macho e o seu papel na regulación da receptividade sexual feminina, a fertilidade e a interacción co Plasmodium suxiren o potencial de reducir o éxito reprodutivo dos mosquitos transmisores da malaria.
Os casos e as mortes por malaria están a aumentar de novo4 debido á resistencia xeneralizada aos insecticidas nos mosquitos Anopheles, o único vector dos parasitos da malaria humana. A bioloxía de apareamento destes mosquitos é un obxectivo particularmente atractivo para as novas intervencións de control da malaria porque as femias só se aparean unha vez5; facer que este único evento de apareamento sexa estéril tería un gran potencial para reducir as poboacións de mosquitos no campo.
As mulleres quedan sexualmente incapacitadas despois de recibir hormonas esteroides de alto título dos homes. Os estudos demostraron que o desencadeante da dificultade para o apareamento posterior é a 20-hidroxiecdisona (20E), unha hormona esteroide máis coñecida como reguladora do ciclo de muda na fase larvaria. A capacidade dos machos para sintetizar e transferir 20E evolucionou especificamente nas especies de Anopheles que forman parte do subxénero Cellia7, que se distribúe en África e inclúe os vectores máis perigosos da malaria, incluído Anopheles gambiae. Isto é especialmente notable porque nestas especies as femias tamén producen 20E despois de cada inxesta de sangue, e o 20E impulsa o ciclo de ovoxénese (véxase a referencia 8). Non obstante, sábese pouco sobre a forma en que as femias integran sinais de dúas fontes diferentes de ecdisona (transferencia de machos e indución da alimentación sanguínea) sen comprometer a súa propia capacidade de apareamento. De feito, se o 20E producido polas femias desencadea intolerancia sexual, isto levará á infertilidade nos individuos que se alimentan virxes, un comportamento moi común nestes mosquitos5.
Unha posible explicación é que os machos de *A. gambiae* transfiren unha ecdisona modificada específica do macho, que activa unha cascada de sinalización no tracto reprodutivo feminino, o que resulta en inestabilidade no apareamento. Non obstante, aínda que os vertebrados teñen múltiples hormonas esteroides, como estróxenos e andróxenos (revisadas na referencia 9), segundo o noso coñecemento, non se identificaron esteroides con tendencia androxénica nos insectos.
Propuxémonos determinar o repertorio de hormonas esteroides na glándula accesoria masculina (MAG) de A. gambiae sexualmente madura na procura de posibles esteroides modificadores. Usando cromatografía líquida de alta resolución acoplada con espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) en lugar do método menos específico utilizado anteriormente, detectamos ecdisona (E) e 20E neste tecido, confirmando o resultado anterior. Non obstante, a mostra estaba dominada por esteroides fosforilados oxidados, consistente coa fórmula 3-deshidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)12 (Figura 1). Outras formas inclúen 3-deshidro-20E (3D20E) e 20E-22-fosfato (20E22P). A intensidade do sinal HPLC-MS/MS de 3D20E22P foi dúas ordes de magnitude maior que a da súa forma desfosforilada, 3D20E, e tres ordes de magnitude maior que a de E e 20E (Figura 1). Aínda que noutras partes do corpo e da parte inferior tracto reprodutivo (LRT; datos ampliados Fig. 1a). Tamén analizamos ecdisteroides en machos e femias recentemente pechados (<1 día de idade) e detectamos 3D20E e 3D20E22P só en MAG; E, 20E e 20E22P estaban presentes en ambos os sexos (datos ampliados Fig. 1b). Estes datos suxiren que os machos adultos de A. gambiae producen altos títulos de hormonas modificadoras nos seus MAG que non son sintetizadas polas femias.
Diseccionáronse MAG e LRT femininas (incluíndo aurículas, vesículas seminais e parovario) de machos virxes de 4 días de idade e femias virxes e apareadas (0,5, 3 e 12 hpm). A ecdisona nestes tecidos analizouse mediante HPLC-MS/MS (media ± sem; proba t non pareada, bilateral, taxa de descubrimento falso (FDR) corrixida; NS, non significativa; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 horas fronte a 0,5 horas, P = 0,035; 12 horas fronte a 3 horas, P = 0,0015; 12 horas fronte a 0,5 horas, P = 0,030. 3D20E22P: 3 horas fronte a 0,5 horas, P = 0,25; 12 horas fronte a 3 horas, P = 0,0032; 12 horas fronte a 0,5 horas, P = 0,015). Os datos proceden de tres réplicas biolóxicas. A área do pico para cada ecdisona de interese calculouse e normalizouse polo número de mosquitos. A ecdisona represéntase pola seguinte cor: E, verde; 20E, laranxa; 20E22P, morado; 3D20E, azul; 3D20E22P, rosa. O recadro aumenta a escala no eixe y para mostrar niveis máis baixos de ecdisona.
Para investigar se 3D20E22P e 3D20E se transfiren durante o apareamento, diseccionamos LRT femias en varios momentos despois do apareamento. Aínda que non se atopou ecdisona en virxes, observamos cantidades substanciais de 3D20E22P no LRT inmediatamente despois do apareamento (0,5 h despois do apareamento, hpm), diminuíndo co tempo, mentres que os niveis de 3D20E aumentaron significativamente (Fig. 1). Usando 3D20E sintetizado quimicamente como estándar, determinamos que os niveis desta hormona esteroide nos LRT de apareamento eran polo menos 100 veces maiores que os de 20E (Táboa de datos ampliados 1). Polo tanto, 3D20E22P é a principal ecdisona masculina que se transfire ao LRT femia durante o apareamento, e a súa forma desfosforilada, 3D20E, faise moi abundante pouco despois do apareamento. Isto suxire un papel importante para esta última ecdisona na bioloxía pospareamento das femias.
Despois de xerar un novo conxunto de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) (Fig. 2a), empregando unha canle bioinformática personalizada, buscamos a ecdisona quinase (EcK), a ecdisona oxidase (EO) e a ecdisona que codifica o xene da fosfatase modificada con 20E. O EPP) exprésase nos tecidos reprodutivos. Identificamos un xene candidato ao EPP e dous posibles xenes EcK (EcK1 e EcK2), pero non puidemos atopar un bo xene candidato ao EO. Cabe destacar que os xenes EPP individuais expresáronse a niveis altos (percentil 98,9) nos MAG gambianos, pero non nos LRT femininos (Fig. 2b), ao contrario das nosas expectativas, xa que se produciu a desfosforilación de 3D20E22P neste tecido feminino. Polo tanto, cremos que o EPP masculino pode transferirse durante o apareamento. De feito, empregamos o marcado con isótopos estables in vivo para enmascarar a proteína feminina despois do apareamento, un encima identificado por MS na aurícula feminina (Fig. 2c e Táboa suplementaria 1). O A presenza de EPP en MAG e LRT femia apareada (pero non virxe) tamén se confirmou usando anticorpos específicos (Fig. 2d).
a, Unha canle bioinformática personalizada para buscar nos tecidos reprodutivos de cada sexo xenes que codifican EcK, EO e EPP. Os números xunto ás frechas indican o número de candidatos masculinos e femininos en cada paso. Esta análise identificou un xene EPP (EPP) e un xene EcK (EcK1) que se expresan en machos e un xene EcK (EcK2) que se expresa en ambos os sexos pero non produce un xene EO candidato. b, Mapa de calor que compara a expresión de xenes candidatos en tecidos virxes (V) e de apareamento (M) de Anopheles gambiae e Anopheles albicans. Spca, fertilización; MAG, glándulas accesorias en machos; outras partes do corpo, incluíndo peitos, ás, patas, corpos adiposos e órganos internos en ambos os sexos, e ovarios nas femias. A EcK2 exprésase en gran medida tanto en MAG como en aurículas de Gambia, mentres que a EPP só se atopa en MAG. c, Análise proteómica da translocación do grupo do exaculado masculino nas aurículas femininas a 3, 12 e 24 hpm, mostrando as 67 proteínas máis abundantes. As femias criáronse cunha dieta que contiña 15N para marcar (e enmascarar) todas as proteínas. Os machos non etiquetados apareáronse con femias etiquetadas e as LRT femininas diseccionáronse a 3, 12 e 24 hpm para a análise proteómica (véxase a Táboa Suplementaria 1 para obter unha lista completa das proteínas exaculatorias). No cadro, detectáronse EPP, Eck1 e EcK2 no MAG de machos virxes mediante análise proteómica destes tecidos. d, Detectouse EPP mediante Western blot en MAG e LRT de femias apareadas, pero non en femias ou machos virxes nin no resto das femias. corpo. As membranas foron sondadas simultaneamente con anticorpos anti-actina (control de carga) e anti-EPP. Todos os machos son virxes. Véxase a Figura suplementaria 1 para os datos da fonte do xel. As transferencias Western realizáronse dúas veces con resultados similares.
A actividade da fosfofosfatase ecdisteroide do EPP verificouse despois da incubación mediante HPLC-MS/MS con 3D20E22P illado de MAG (Datos ampliados, Fig. 2a). Ademais, cando silenciamos o EPP mediante interferencia mediada por ARN (RNAi), detectamos unha forte redución na actividade da fosfatase nos tecidos reprodutivos destes machos (Fig. 3a), e as femias apareadas con machos silenciados por EPP mostraron unha proporción significativamente menor de 3D20E desfosforilado (Fig. 3b) a pesar do silenciamento xénico parcial (Datos ampliados, Fig. 2b e c). Pola contra, non detectamos cambios significativos na proporción 20E22P/20E nos mesmos mosquitos, o que podería suxerir que o encima é específico para o 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Diminución da actividade da fosfatase en MAG causada polo silenciamento de EPP usando controis de ARN EPP bicatenario (dsEPP) ou ARN GFP bicatenario (dsGFP). Usáronse vinte conxuntos de MAG en cada réplica (P = 0,0046, proba t emparellada, bilateral), representados por puntos separados. b, As femias apareadas con machos silenciados con EPP tiveron unha proporción significativamente menor de 3D20E desfosforilado a 3 hpm (P = 0,0043, proba t non emparellada, bilateral), mentres que os niveis de 20E non se viron afectados (P = 0,063, non emparellado). Proba t, bilateral). Os datos preséntanse como media ± sem de tres grupos de 13, 16 e 19 femias cada un.c, As femias apareadas con machos silenciados con EPP tiveron taxas de re-apareamento significativamente máis altas (P = 0,0002, proba exacta de Fisher, bilateral). As femias foron obrigadas primeiro a aparearse para garantir o seu estado de apareamento; Dous días despois, contactáronos con outros machos portadores de esperma transxénico para avaliar as taxas de re-apareamento mediante a detección cuantitativa por PCR do transxene.d As femias alimentadas con sangue e apareadas con machos silenciados con EPP tiveron unha fertilidade significativamente reducida (P < 0,0001; proba de Mann-Whitney, bilateral) e un número de ovos lixeiramente reducido (P = 0,088, proba de Mann-Whitney, bilateral), mentres que a taxa de desova non se viu afectada (P = 0,94, proba exacta de Fisher, bilateral). En todos os paneis, n representa o número de mostras de mosquitos bioloxicamente independentes. NS, non significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
A continuación, avaliamos se a desfosforilación da ecdisona é importante para inducir a resistencia ao apareamento nas femias. En particular, as femias que se aparearon con machos con deficiencia de EPP volveron aparearse cunha frecuencia moito maior (44,9 %) que as femias de control (10,4 %) cando se expuxeron a machos (transxénicos) adicionais (Fig. 3c). Tamén observamos unha diminución significativa da fertilidade (Fig. 3d, esquerda) e unha lixeira diminución no número de ovos postos por estas femias (Fig. 3d, centro), mentres que a porcentaxe de ovos postos polas femias (outra resposta provocada nas femias polo apareamento) non se viu afectada (Fig. 3d, dereita). Dada a especificidade observada do EPP para 3D20E22P, estes resultados suxiren que a activación de 3D20E polo EPP transferido durante o apareamento pode ter un papel importante na desactivación da receptividade das femias a un maior apareamento, un comportamento que se atribuía previamente á transferencia sexual de 20E. Polo tanto, esta hormona específica do macho tamén afecta fortemente á fertilidade feminina.
A continuación, comparamos as actividades de 20E e 3D20E en experimentos de inxección en virxes sexualmente maduras utilizando 3D20E sintetizado quimicamente (Fig. 4a-c) e 20E dispoñible comercialmente. Observamos que o 3D20E foi significativamente máis eficaz que o 20E para desactivar a sensibilidade das femias ao apareamento en ambas as concentracións (Fig. 4d). Cabe destacar que a metade do nivel fisiolóxico de 3D20E na LRT (1.066 pg despois da inxección fronte a 2.022 pg despois do apareamento) induciu unha proporción de femias refractarias que foi 20 veces maior que o nivel fisiolóxico de 20E (361 pg despois da inxección) 24 horas despois da inxección á concentración máis alta, 18 pg despois do apareamento; Táboa de datos ampliados 1). Este resultado é consistente coa idea de que a transferencia sexual de 20E non causa períodos refractarios de apareamento e sinala ademais a 3D20E como un factor importante para garantir a relación pai-fillo. O 3D20E tamén foi significativamente máis activo que o 20E nos ensaios de posta de ovos en femias virxes (Fig. 4e), o que suxire que a taxa normal de posta de ovos que observamos despois do silenciamento parcial do EPP se debía á presenza de actividade residual de 3D20E aínda producida por factores femininos inducidos polo apareamento.
(a, b) 3D20E sintetizado quimicamente a partir de 20E (a) con conversión/eficiencia moi alta (datos presentados como media ± sem de tres reaccións de síntese independentes) (b).c, O espectro de masas (metade inferior) coincide exactamente coa ecdisona atopada na LRT femia apareada (metade superior).d, Comparado con 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; proba exacta de Fisher, bilateral) e etanol ao 10 % (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; proba exacta de Fisher, bilateral), mentres que 20E foi significativamente maior que o control só en doses máis altas (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; proba exacta de Fisher, bilateral).e, 3D20E A inxección induciu taxas de desova significativamente maiores en femias virxes que nos controis con etanol ao 10 % (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; proba exacta de Fisher, bilateral), mentres que 20E en comparación cos controis só a doses máis altas (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; proba exacta de Fisher, bilateral). 3D20E induciu taxas de desova significativamente maiores que 20E a doses máis altas (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; proba exacta de Fisher, bilateral). En todos os paneis, n representa o número de mostras de mosquitos bioloxicamente independentes. NS, non significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Os datos proceden de tres réplicas.
En estudos previos, determinamos que a transferencia sexual de hormonas esteroides induce a expresión de MISO (Estimulador da Ovoxénese Inducido polo Apareamento 11), un xene reprodutivo feminino que protexe as femias de *A. gambiae* da infección por *P. falciparum*. Custos sanitarios causados por *13*, o parasito da malaria humana máis mortal. Dada a importancia de MISO para a aptitude reprodutiva de *Anopheles* en zonas endémicas da malaria, decidimos determinar que hormona 3D20E ou 20E desencadea a expresión deste xene. Descubrimos que, aínda que a inxección de 20E inducía de forma específica ou máis potente algúns receptores de hormonas nucleares (HR), como HR3 e HR4, e dianas esteroides típicas augas abaixo, como os xenes yolkoxénicos Vg14, 15, 16, o MISO era inducido con maior forza por 3D20E (Datos Ampliados, Figura 3). Polo tanto, a transferencia sexual desta hormona esteroide androxénica parece inducir mecanismos que protexen as femias dos custos que supón a infección parasitaria. Ademais, o 3D20E afecta diferencialmente a ambos... isoformas do receptor E EcR, que inducen EcR-A e reprimen EcR-B, e que desencadean con maior forza outros xenes indutores do apareamento, incluído HPX15, que afecta a fertilidade feminina. Isto podería explicar a significativa infertilidade observada en femias apareadas con machos silenciados por EPP (Datos ampliados Fig. 3). Estes datos suxiren a existencia de vías posteriores activadas preferentemente por dúas hormonas ecdisona que poden ser a causa da función específica do sexo.
A continuación, probamos a función dos dous xenes EcK identificados na nosa canle de bioinformática. O silenciamento de EcK1 ou EcK2 provocou unha mortalidade significativa nos machos (Datos ampliados Fig. 4a), o que suxire que a fosforilación da ecdisona e, polo tanto, a súa inactivación, é importante para a supervivencia. Dado que EcK2 expresouse a niveis máis altos que EcK1 e detectouse en MAG mediante proteómica (Fig. 2b, c e Táboa suplementaria 2), validamos a súa actividade quinase ecdisteroide incubándoa con 20E, o que resultou na fosforilación de 20E22P (Datos ampliados Figura 2). 4b). Ao usar 3D20E como substrato, non puidemos detectar o produto fosforilado 3D20E22P (Datos ampliados Fig. 4c), o que suxire que 20E en lugar de 3D20E pode ser o obxectivo preferido de EcK2.
Segundo a nosa análise de secuenciación de ARN, a EcK2 tamén se expresou en gran medida na LRT de femias virxes, onde se desactivou despois do apareamento (Fig. 2b). Confirmamos estes datos e determinamos que a expresión de EcK2 non se vía afectada pola alimentación con sangue (Datos ampliados Fig. 5a). Ampliando os nosos experimentos iniciais de MS, determinamos que o pico de 20E22P estaba estreitamente relacionado co pico de 20E (22-26 horas despois da inxestión de sangue; Datos ampliados Fig. 5b). O silenciamento de EcK2 en femias virxes resultou nun aumento de 3 veces na proporción relativa de 20E a 20E22P ás 26 horas despois da inxestión de sangue (Figuras de datos ampliados 2c e 5c), o que confirma que EcK2 tamén fosforila 20E nas femias. En particular, as virxes con depleción de EcK2 mantiveron unha receptividade sexual completa (Datos ampliados Fig. 5d, e), o que suxire aínda máis que a produción femenina de 20E non induce períodos refractarios de apareamento. Non obstante, estas femias tiñan aumentou significativamente as taxas de posta de ovos en comparación cos controis, con máis do 30 % das virxes poñendo ovos (Datos ampliados, figura 5f). Se as inxeccións de ARN bicatenario Eck2 (dsEcK2) se realizaron despois da alimentación con sangue, a desova non se produciu, momento no que o pico de 20E debido á inxestión de sangue diminuíu. En xeral, estes resultados apoian un modelo de que o 20E producido despois da succión de sangue pode inducir a desova, pero só cando o bloqueo da desova (EcK2 e posiblemente outros factores) se desactiva polo apareamento. Nin as inxeccións de 20E nin as de 3D20E inhibiron a expresión de EcK2 en virxes (Datos ampliados, figura 5g), o que suxire que outros factores median a inhibición desta quinase. Non obstante, os niveis de 20E despois da alimentación con sangue non foron suficientes para inducir molestias de apareamento, senón que foron desencadeados eficazmente por altos títulos de 3D20E transferido sexualmente.
Os nosos resultados proporcionan información importante sobre os mecanismos que regulan o éxito reprodutivo de *A. gambiae*. Xurdiu un modelo no que os machos evolucionaron para sintetizar altos títulos de 3D20E, unha ecdisona modificada específica do macho que asegura a paternidade ao desensibilizar as femias a un apareamento posterior. Ao mesmo tempo, estes vectores da malaria tamén desenvolveron un sistema eficiente para activar 3D20E nas femias en resposta á transferencia sexual de EPP específico do macho. Ata onde sabemos, este é o primeiro exemplo dun sistema de hormonas esteroides dominado por machos e femias que realiza unha función única e crítica nos insectos. A función da ecdisona específica do macho foi postulouse pero non demostrada definitivamente. Por exemplo, unha hipótese amplamente refutada 18 é que estas funcións poden ser realizadas polo precursor 20E E1. É ben sabido que en *Drosophila*, a monandria é desencadeada pola transferencia sexual de pequenos péptidos sexuais 19,20 que interactúan coas neuronas que inervan o tracto reprodutivo feminino a través de receptores específicos de péptidos sexuais 21,22. É necesario seguir traballando para determinar as fervenzas de sinalización augas abaixo. controlado por 3D20E en femias de A. gambiae e para determinar se estas fervenzas poden conservarse entre mosquitos e Drosophila.
Dado o importante papel do 3D20E na fertilidade e o comportamento das femias identificados no noso estudo, as vías que levan á síntese e activación do 3D20E ofrecen novas oportunidades para futuras estratexias de control de mosquitos, como a xeración de machos estériles competitivos en estratexias de tecnoloxía de insectos estériles. Uso para a liberación en liberdade ou para imitar o 3D20E no xogo virxe. A función específica do macho do 3D20E pode ter evolucionado cando A. gambiae e outras especies de Cellia adquiriron a capacidade de coagular o seu seme en tapóns de apareamento, xa que isto permite a transferencia eficiente dun gran número de hormonas e encimas activadores de hormonas. Pola súa banda, a evolución do 3D20E que implementa a monandria proporciona un mecanismo para que as femias (a través da alta expresión de MISO) favorezan a súa aptitude reprodutiva en áreas de alta prevalencia de malaria, o que contribúe indirectamente á transmisión do Plasmodium. Dado que se demostrou que o 20E feminino ten profundos efectos na supervivencia e o crecemento de P. falciparum nas femias de mosquitos Anopheles,24 tanto as vías das hormonas esteroides masculinas como femininas son agora aspectos clave das interaccións mosquito-parasito.
As cepas G3 de *A. gambiae* criáronse en condicións estándar para insectos (26-28 °C, humidade relativa do 65-80 %, fotoperíodo de luz/escuridade de 12:12 h). As larvas alimentáronse con alimento para peixes en po (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets e Tetra Pond Sticks nunha proporción de 7:7:2). Os mosquitos adultos alimentáronse ad libitum cunha solución de dextrosa ao 10 % e sangue humano semanalmente (estudo de compoñentes sanguíneos). Os mosquitos virxes obtivéronse segregando os sexos na fase de pupa despois de examinar os extremos mediante microscopía. Os machos portadores do transxén DsRed foron descritos previamente.
Os experimentos de apareamento forzado realizáronse segundo os protocolos descritos previamente. Para o apareamento natural, as femias virxes de 4 días de idade mantivéronse nunha proporción de 1:3 con machos virxes sexualmente maduros durante dúas noites. Para os experimentos nos que se inxectou aos machos dsEPP, a colocación en gaiola coincidiu cos días 3-4 posteriores á inxección, cando a actividade da fosfatase se silenciou ao máximo (Datos ampliados, figura 2b).
Os tecidos de mosquito, os cadáveres restantes (resto do corpo) ou o corpo enteiro foron diseccionados en metanol ao 100 % e homoxeneizados cunha esfera de vidro (esferas de vidro de 2 mm, 2400 rpm, 90 s). As cantidades de tecido e os volumes de metanol foron os seguintes: resto do corpo, 50 en 1000 µl; MAG, 50–100 × 80 µl; LRT feminina, 25–50 × 80 µl. O precipitado someteuse a unha segunda extracción con metanol co mesmo volume de metanol. Os restos celulares elimináronse por centrifugación. O metanol de ambas as extraccións combinouse e secouse baixo fluxo de nitróxeno, e logo resuspendiuse nos seguintes volumes de metanol ao 80 % en auga: resto do corpo, 50 µl; MAG e LRT feminina, 30 µl.
As mostras analizáronse nun espectrómetro de masas (ID-X, Thermo Fisher) acoplado a un instrumento LC (Vanquish, Thermo Fisher). Inxectáronse 5 µl de mostra nunha columna de 3 µm e 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantida a 25 °C. As fases móbiles para a LC foron A (auga, 0,1 % de ácido fórmico) e B (acetonitrilo, 0,1 % de ácido fórmico). O gradiente de LC foi o seguinte: 5 % de B durante 1 minuto, despois aumentouse ao 100 % de B durante 11 minutos. Despois de 8 minutos ao 100 %, reequilibrouse a columna ao 5 % de B durante 4 minutos. O caudal foi de 0,3 ml min-1. A ionización na fonte MS realízase mediante ionización por electropulverización quentada en modos positivo e negativo.
O espectrómetro de masas mide datos no rango m/z de 350 a 680 a unha resolución de 60.000 en modo MS completo. Os datos de MS/MS adquiríronse en [M + H]+ (todos os obxectivos), [M - H2O + H]+ (todos os obxectivos) e [M - H]- (obxectivos fosforilados). Os datos de MS/MS utilizáronse para confirmar as propiedades da ecdisona dos obxectivos para os que non había ningún estándar dispoñible. Para identificar ecdisteroides non dirixidos, analizáronse os datos de MS/MS para todos os picos de HPLC cunha abundancia relativa >15%. Cuantificar usando curvas estándar creadas a partir de estándares puros (20E, 3D20E) para calcular cantidades absolutas ou dilucións dunha mostra específica (todos os demais obxectivos) para calcular a súa equivalencia coas cantidades atopadas nun macho. Para 3D20E, a cuantificación realizouse usando a suma dos seguintes adutos: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Os datos extraéronse e cuantificáronse usando Tracefinder (versión 4.1). Os datos de MS/MS analizáronse usando Xcalibur (versión 4.4). Os espectros de MS de E, 20E e 3D20E comparáronse cos respectivos estándares. O 3D20E22P analizouse por derivatización co reactivo de Girard. O 20E22P analizouse pola relación m/z.
O 3D20E22P purificouse a partir de MAG. A purificación realizouse a escala analítica empregando un cromatógrafo líquido de ultra rendemento (Acquity, Waters) cun detector baseado en masa cuadrupolar (QDa, Acquity, Waters) nas mesmas condicións de LC que a análise HPLC-MS/MS. A recollida de fraccións activouse cando se detectou o m/z correspondente ao 3D20E22P no mesmo tempo de retención que o determinado previamente. A continuación, comprobouse a pureza dos compostos extraídos mediante HPLC-MS/MS como se describiu anteriormente.
Extraeuse ARN total de 10-12 tecidos reprodutivos ou outras partes do corpo (sen cabeza) usando o reactivo TRI (Thermo Fisher) seguindo as instrucións do fabricante. O ARN tratouse con TURBO DNase (Thermo Fisher). O ADNc sintetizouse usando a transcriptase inversa do virus da leucemia murina de Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) seguindo as instrucións do fabricante. Os cebadores para a PCR cuantitativa con transcrición inversa (RT-qPCR; Táboa de datos ampliada 2) publicáronse previamente24 ou deseñáronse usando Primer-BLAST26, dando preferencia a produtos de 70-150 pb de tamaño e que abarcan unións exón-exón ou cebadores de pares de cebadores por exóns separados. As mostras de ADNc de tres a catro réplicas biolóxicas diluíronse catro veces en auga para RT-qPCR. A cuantificación realizouse en reaccións réplicas de 15 µl que contiñan 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), cebadores e 5 µl de ADNc diluído. As reaccións executáronse nun QuantStudio 6 Pro Sistema de PCR en tempo real (Thermo Fisher) e os datos recolléronse e analizáronse mediante Deseño e Análise (versión 2.4.3). Como se demostrou neste estudo, as cantidades relativas normalizáronse co xene ribosómico RpL19 (AGAP004422), cuxa expresión non cambiou significativamente coa alimentación con sangue 27 nin co apareamento 3.
A calidade do ARN comprobouse cun Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). As bibliotecas de extremos pareados Illumina preparáronse e executáronse no Broad Institute do MIT e Harvard. As lecturas de secuenciación aliñáronse co xenoma de A. gambiae (cepa PEST, versión 4.12) usando HISAT2 (versión 2.0.5) con parámetros predeterminados. As lecturas con puntuacións de calidade de mapeo (MAPQ) <30 elimináronse usando Samtools (versión 1.3.1). O número de lecturas mapeadas a xenes contouse usando htseq-count (versión 0.9.1) con parámetros predeterminados. Calculáronse os recontos de lecturas normalizados e analizouse a expresión xénica diferencial usando o paquete DESeq2 (versión 1.28.1) en R (versión 4.0.3).
Os candidatos a xenes modificadores de ecdisona identificáronse buscando primeiro no xenoma de *A. gambiae* usando o algoritmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), usando valores predeterminados de parámetros coas seguintes secuencias de proteínas de consulta: de *Bombyx mori* (nº de acceso NP_001038956.1), *Musca domestica* (nº de acceso XP_005182020.1, XP_005175332.1 e XP_011294434.1) e *Microplitis demolitor* (nº de acceso XP_008552646.1 e XP_008552645.1), *EcK* de *B. mori* (nº de acceso NP_001036900), *Drosophila melanogaster* (nº de acceso NP_651202), *Apis mellifera*. (nº de acceso XP_394838) e Acyrthosiphon pisum (nº de acceso XP_001947166); e EPP de B. mori (nº de acceso XP_001947166) NP_001177919.1 e NP_001243996.1) e EO de D. melanogaster (nº de acceso NP_572986.1) (paso 1). A continuación, filtre os resultados baseados na alta expresión de ARNm (>100 fragmentos/quilobase exóns por millón de lecturas mapeadas (FPKM) ou >85 %) en tecido reprodutivo (LRT feminina ou MAG) en Gambia (paso 2). Para mellorar a especificidade, seleccionamos encimas candidatos que tamén se expresan no tecido reprodutivo de *A. albimanus*, unha especie de *anopheles* que non sintetiza nin transfire ecdisona durante o apareamento. Os xenes candidatos filtráronse en función da baixa expresión (<100 FPKM ou
Femias virxes de 4 a 6 días de idade e etiquetadas con 15N foron obrigadas a aparearse con machos virxes sen etiquetar da mesma idade. O apareamento exitoso verificouse detectando tapóns de apareamento baixo microscopía de epifluorescencia. A 3, 12 e 24 hpm, as aurículas de 45-55 femias apareadas foron diseccionadas en 50 µl de tampón de bicarbonato de amonio (pH 7,8) e homoxeneizadas cun manolo. O homoxeneizado foi centrifugado e o sobrenadante mesturado con 50 µl de RapiGest ao 0,1 % (186001860, Waters) en bicarbonato de amonio a 50 mM. O sobrenadante e o precipitado de cada mostra foron conxelados rapidamente en xeo seco e enviados durante a noite ao laboratorio MacCoss da Universidade de Washington, onde se completou a preparación da mostra para LC-MS/MS. Resuspender o precipitado en 50 µl de RapiGest ao 0,1 % en bicarbonato de amonio a 50 mM e sonicar nun baño de auga. A concentración de proteínas do precipitado e do sobrenadante mediuse mediante o ensaio BCA, as mostras reducíronse con 5 mM de ditiotreitol (DTT; Sigma), alquiláronse con 15 mM de iodoacetamida (Sigma) e incubáronse a 37 °C (1:0 50) durante 1 hora con proporción tripsinización:tripsina:substrato). RapiGest lisouse mediante a adición de 200 mM de HCl, seguido de incubación a 37 °C durante 45 minutos e centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para eliminar os residuos. As mostras laváronse mediante extracción en fase sólida de modo dual (cartuchos Oasis MCX, Waters) e resuspendiuse en ácido fórmico ao 0,1 % para unha concentración final de proteínas de 0,33 µg µl-1. Os proteomas MAG sen marcar analizáronse de xeito similar a partir de machos virxes. Analizáronse dúas réplicas analíticas para cada mostra. A continuación, Analizouse 1 µg de cada un empregando unha columna de sílice fundida de 25 cm e 75 μm cunha trampa de fritas Kasil1 (PQ) de sílice fundida de 4 cm recheada con resina de fase inversa Jupiter C12 (Phenomenex) e cromatografía líquida de 180 minutos. Dixestións de mostras: a MS/MS executouse nun espectrómetro de masas Q-Exactive HF (Thermo Fisher) cun sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). Os datos de adquisición relacionados cos datos xerados para cada execución convertéronse a formato mzML usando Proteowizard (versión 3.0.20287) e usando Comet31 (versión 3.2) contra a base de datos FASTA que contén secuencias de proteínas de Anopheles gambiae (VectorBase versión 54), Anopheles coluzzi. Realizouse unha busca en Mali-NIH (VectorBase versión 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marzo de 2021), A. gambiae RNA-seq e traducións de tres marcos de contaminantes humanos coñecidos. As FDR coincidentes co mapa de péptidos determináronse usando Percolator32 (versión 3.05) cun limiar de 0,01, e os péptidos ensambláronse en identificacións de proteínas usando parsimonia de proteínas en Limelight33 (versión 2.2.0). Proteína relativa A abundancia estimouse usando o factor de abundancia espectral normalizado (NSAF) calculado para cada proteína en cada execución, como se describiu anteriormente. O NSAF relativo a cada proteína calculouse a media entre mostras de dúas réplicas biolóxicas diferentes. O marcado con 15N enmascou con éxito o proteoma feminino, aínda que se puido detectar unha pequena cantidade de proteína non marcada nas virxes etiquetadas. Rexistramos a detección da redución da proteína masculina (espectros de 1 a 5) en mostras crúas femininas só en execucións técnicas, onde as mostras crúas se executaron despois das mostras masculinas/de apareamento, como resultado do "arrastre" por HPLC. As proteínas ocasionais que se atopan como "contaminantes" das virxes etiquetadas enuméranse na Táboa complementaria 1.
Dous péptidos antixénicos, QTTDRVAPAPDQQQ (dentro do isotipo PA) e MESDGTTPSGDSEQ (dentro do isotipo PA e PB) en Genscript. Os dous péptidos combináronse, conxugáronse coa proteína transportadora KLH e inxectáronse en coellos de Nova Zelandia. Os coellos sacrificáronse despois da cuarta inxección e illouse a IgG total por purificación por afinidade. A IgG do coello máis específico de EPP utilizouse para Western blot adicional.
Para as transferencias western, engadíronse por separado MAG (n = 10, onde n representa o número de mostras de mosquitos bioloxicamente independentes) e LRT de femias (n = 30) de machos virxes de 4 días de idade e femias virxes ou apareadas por forza (<10 despois do apareamento), tampón de extracción de proteínas (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % desoxicolato de sodio; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; cóctel de inhibidores de protease 1× (Roche)). As mostras homoxenizáronse inmediatamente despois da disección cun esfera (esferas de vidro de 2 mm, 2400 rpm, 90 segundos). Os restos insolubles elimináronse por centrifugación a 20 000 g a 4 °C. As proteínas cuantificáronse mediante ensaio de Bradford (Bio-Rad). Despois, engadíronse 20 µg de proteína MAG, 40 µg de proteína LRT e 20 µg de proteína residual a granel. desnaturalizáronse e separáronse mediante un 10 % de Bis-Tris NuPAGE usando tampón MOPS. As proteínas transferíronse a membranas de fluoruro de polivinilideno usando o sistema de transferencia iBlot2 (Thermo Fisher). As membranas laváronse dúas veces en PBS-T 1× (0,1 % de Tween-20 en PBS) e despois bloqueáronse en tampón de bloqueo Odyssey (Li-Cor) durante 1 hora a 22 °C. As membranas axitáronse durante a noite a 4 °C cun anticorpo primario policlonal de coello anti-EPP personalizado (1:700 en tampón de bloqueo) e un anticorpo primario monoclonal de rata anti-actina MAC237 (Abeam; 1:4.000). As membranas laváronse con PBS-T e despois incubáronse con anticorpos secundarios (burro anti-coello 800CW e cabra anti-rata 680LT (Li-Cor), ambos 1:20.000) en tampón de bloqueo que contiña SDS ao 0,01 % e Tween-20 ao 0,2 % durante 1 hora. hora a 22 °C. As membranas laváronse con PBS-T e visualizáronse cun escáner Odyssey CLx. As imaxes recolléronse e procesáronse en Image Studio (versión 5.2). Non se detectou unha banda específica correspondente á isoforma EPP-RA (82 kDa).
As rexións codificantes de EPP (como isoforma AGAP002463-RB que contén o dominio de histidina fosfatase, busca de dominios conservados do NCBI 34) e EcK2 (AGAP002181) foron clonadas no plásmido pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Os cebadores aparecen na Táboa de datos ampliados 2. Inseríronse oito conectores GS4 (en tándem) antes da etiqueta 6xHis C-terminal da construción pET-21a(+)-EcK2. As proteínas recombinantes producíronse usando a reacción de síntese de proteínas de E. coli sen células NEBExpress (New England BioLabs). As proteínas recombinantes purificáronse usando columnas de centrifugación NEBExpress Ni (New England BioLabs). A proteína de control da dihidrofolato redutase (DHFR) produciuse usando o molde de ADN do kit de síntese de proteínas de E. coli sen células NEBExpress. As proteínas almacenáronse en glicerol ao 50 % en PBS a -20 °C durante un máximo de 3 meses.
A actividade fosfatase do EPP e dos extractos de tecidos mediuse usando fosfato de 4-nitrofenilo (pNPP; Sigma-Aldrich). O tampón de reacción contiña 25 mM de Tris, 50 mM de ácido acético, 25 mM de Bis-Tris, 150 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA e 1 mM de DTT. O tecido homoxenizouse no tampón de reacción e os restos celulares elimináronse por centrifugación. Iniciouse a reacción engadindo encima ou extracto de tecido ao tampón de reacción que contiña 2,5 mg de ml-1 de pNPP. A mestura de reacción incubouse a temperatura ambiente na escuridade e a cantidade de pNP convertida a partir de pNPP cuantificouse medindo a absorbancia a 405 nm en varios momentos.
Para a actividade EcK in vitro, a proteína incubouse con 0,2 mg de 20E ou 3D20E en 200 µl de tampón (pH 7,5) que contiña 10 mM de HEPES-NaOH, 0,1 % de BSA, 2 mM de ATP e 10 mM de MgCl2 durante 2 h a 27 °C. A reacción detívose engadindo 800 µl de metanol, arrefriouse a -20 °C durante 1 hora e centrifugouse a 20 000 g durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante analizouse mediante HPLC-MS/MS. Para inactivar por calor as proteínas empregadas no grupo de control, as proteínas incubáronse en glicerol ao 50 % en PBS durante 20 min a 95 °C.
Para a actividade EPP in vitro, a proteína incubouse con 3D20E22P (equivalente á cantidade atopada en 18 pares de MAG, purificados por HPLC-MS/MS) en 100 µl de tampón (pH 7,5) que contiña 25 mM de Tris, 50 mM de ácido acético, 25 mM de Bis-Tris, 150 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA e 1 mM de DTT durante 3 horas a 27 °C. A reacción detívose engadindo 400 µl de metanol e arrefriouse a -20 °C durante 1 hora, e despois centrifugouse a 20.000 g durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante analizouse por HPLC-MS/MS.
Os fragmentos de PCR para EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) e EcK2 (556 pb) amplificáronse a partir de ADNc preparado a partir de cadáveres de mosquitos sen cabeza de sexos mixtos. O fragmento de PCR do control eGFP (495 pb) amplificouse a partir do pCR2.1-eGFP descrito previamente; Os cebadores de PCR están listados na Táboa de datos ampliados 2. O fragmento de PCR inseriuse entre os promotores T7 invertidos no plásmido pL4440. As construcións plasmídicas recuperáronse de E. coli competente para NEB 5-α (New England Biolabs) e verificáronse mediante secuenciación de ADN antes do seu uso (véxase os datos suplementarios 1 para a secuencia do inserto). Os cebadores coincidentes co promotor T7 (Táboa de datos ampliados 2) utilizáronse para amplificar o inserto do plásmido baseado en pL4440. O tamaño do produto de PCR confirmouse mediante electroforese en xel de agarosa. O ARN bicatenario transcribiuse a partir de modelos de PCR usando o kit de transcrición Megascript T7 (Thermo Fisher) e purificouse segundo as instrucións do fabricante coas modificacións descritas anteriormente.
Para a inxección de ARN bicatenario, inxectáronse 1380 ng de ARN bicatenario (GFP bicatenario, EcK1, EcK2, EPP bicatenario) a unha concentración de 10 ng de nl-1 no tórax de machos ou femias adultos (Nanoject III, Drummond) nun prazo dun día despois da eclosión. Os niveis de inhibición xénica determináronse en polo menos tres réplicas biolóxicas mediante extracción de ARN, síntese de ADNc e RT-qPCR. Para a inxección de ecdisona, inxectáronse 0,13, 0,21 ou 0,63 µg de 20E ou 3D20E (Nanoject III, Drummond) a concentracións de 1,3, 2,1, respectivamente, dependendo do deseño experimental, ou 6,3 ng de nl-1. Inxectáronse 100 nl de etanol ao 10 % (vol/vol) en auga; 100 nl de 3D20E22P en etanol ao 10 % (equivalente ao 75 % da cantidade atopada nun par de MAG). Os mosquitos foron asignados aleatoriamente ao grupo de inxección.
Para os ensaios de desova, alimentáronse femias de 3 días de idade ad libitum con sangue humano. Retiráronse os mosquitos parcialmente alimentados ou non. Dependendo do tratamento, as femias colocáronse en copas de desova separadas durante catro noites, polo menos 48 horas despois da inxestión de sangue. Os ovos contáronse baixo un estereoscopio (Stemi 508, Zeiss); para as femias apareadas, os ovos que eclosionaron en larvas consideráronse fértiles.
Para as probas de apareamento, as femias recibiron polo menos 2 días dependendo do tratamento para desenvolver resistencia ao apareamento, e posteriormente introducíronse na mesma gaiola machos de tipo salvaxe da mesma idade. Dúas noites despois, diseccionáronse as vesículas fertilizadas das femias e liberouse ADN xenómico por conxelación-desconxelación e sonicación nun tampón que contiña 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA e 25 mM de NaCl (pH 8,2). As mostras incubáronse con proteinase K (0,86 µg µl-1) durante 15 minutos a 55 °C, seguido de 10 minutos a 95 °C. As preparacións de ADN xenómico bruto diluíronse 10 veces e sometéronse a detección por qPCR das secuencias do cromosoma Y; os cebadores aparecen na Táboa de datos ampliados 2. A ausencia da secuencia do cromosoma Y indica que non houbo apareamento.
Para os ensaios de re-apareamento, examináronse as femias apareadas á forza para detectar a presenza de tapóns de apareamento para confirmar o estado de apareamento e deixáronse 2 días para que desenvolvesen resistencia ao apareamento en ausencia de machos, como se describiu previamente36. Os machos que portaban espermatozoides transxénicos DsRed introducíronse entón en gaiolas para femias. Dúas noites despois, diseccionáronse as vesículas fertilizantes das femias e preparouse ADN xenómico como se describiu anteriormente e sometéuse a detección por qPCR do transxén DsRed; os cebadores están listados na Táboa de datos ampliados 2. A ausencia do transxén DsRed indicou que non se produciu re-apareamento.
O 3D20E sintetizouse como se describiu previamente37. En resumo, disolvéronse 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) en 10 ml de auga, seguido da adición de 30 mg de negro de platino (en po, Sigma-Aldrich). Borbullouse continuamente unha corrente suave de O2 na mestura de reacción, que se axitou a temperatura ambiente. Despois de 6 horas, engadíronse 30 mL de metanol para deter a reacción. A mestura centrifugouse para eliminar as partículas do catalizador. O sobrenadante evaporouse ata secar ao baleiro a temperatura ambiente. O produto de reacción seco disolveuse en etanol ao 10 % e metanol para a súa inxección para a análise HPLC-MS/MS. A taxa de conversión (de 20E a 3D20E) foi de aproximadamente o 97 % (Fig. 4b) e o espectro de MS do 3D20E sintetizado coincidiu co atopado nas femias apareadas (Fig. 4c).
A lenda contén detalles específicos das probas estatísticas realizadas. GraphPad (versión 9.0) utilizouse para realizar a proba exacta de Fisher, a proba de Mantel-Cox e a proba t de Student. As probas de Cochran-Mantel-Haenszel realizáronse cun script R personalizado (dispoñible en https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). A distribución de datos comprobouse a normalidade mediante a proba de Shapiro-Wilk cun limiar de significancia de 0,05. Cando os datos fallaron na proba de normalidade, realizouse a proba de Mann-Whitney. Os datos de supervivencia analizáronse mediante a proba de Mantel-Cox. O paquete DESeq2 (versión 1.28.1) utilizouse para realizar a análise de expresión diferencial a nivel de xenes de RNA-seq. A barra horizontal do gráfico representa a mediana. Utilizouse un valor de significancia de P = 0,05 como limiar para todas as probas.
Para obter máis información sobre o deseño do estudo, consulta o resumo de Nature Research Report que se enlaza con este artigo.
Os datos proteómicos de MS foron depositados no ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través do PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) co identificador de conxunto de datos PXD032157.
O conxunto de datos de RNA-seq está depositado na Biblioteca Completa de Expresión Xénica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) baixo o rexistro de serie GSE198665.
Os conxuntos de datos adicionais xerados e/ou analizados durante o estudo actual poden obterse dos autores correspondentes se se solicitan con razoable solicitude. Este artigo proporciona os datos de orixe.
De Loof, A. Ecdisteroides: esteroides sexuais de insectos esquecidos? Masculino: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroxiecdisona e desenvolvemento ovárico en Anopheles stephens. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).
Data de publicación: 08-07-2022