Javascript está desactivado no teu navegador. Algunhas funcións deste sitio web non funcionarán cando Javascript estea desactivado.
Rexístrate cos teus datos específicos e o medicamento específico que che interese e nós combinaremos a información que nos proporciones cos artigos da nosa extensa base de datos e enviarémosche unha copia en PDF por correo electrónico inmediatamente.
Os gránulos de Ban-Lan-Gen atenúan a colite crónica recorrente inducida por sulfato de dextrano sódico en ratos mediante a modulación da microbiota intestinal e a restauración da produción intestinal de GLP-1 derivado de SCFA.
Jiao Peng, 1-3, * Li Xi, 4, * Zheng Lin, 3, 5 Duan Lifang, 1 Gao Zhengxian, 2, 5 Diehu, 1 Li Jie, 6 Li Xiaofeng, 6 Shen Xiangchun, 5 Xiao Haitao21 Universidade de Pequín, Hospital de Shenzhen, Departamento de Farmacia, Shenzhen, República Popular da China; 2 Centro de Ciencias da Saúde da Universidade de Shenzhen, Facultade de Farmacia, Shenzhen, República Popular da China; 3 Universidade Médica de Guizhou, Centro de Investigación de Tecnoloxía de Enxeñaría de Medicina Étnica e Desenvolvemento e Aplicación da Medicina Tradicional Chinesa; Ministerio de Educación, Laboratorio Clave Provincial de Farmacia de Guizhou, Universidade Médica de Guizhou, Guiyang, República Popular da China; 4 Departamento de Gastroenteroloxía, Hospital Universitario de Pequín de Shenzhen, Shenzhen, República Popular da China; 5 Facultade de Farmacia, Universidade Médica de Guizhou, Laboratorio Clave Estatal de Función e Aplicación de Plantas Medicinais, Guiyang; 6 Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Universitario de Pequín de Shenzhen, Shenzhen, China [email protected] Shen Xiangchun, Escola de Farmacia, Universidade Médica de Guizhou, Guizhou, República Popular da China, 550004, Correo electrónico [email protected] Obxectivo: A terapia baseada en GLP-1 é unha nova opción de tratamento para a enfermidade inflamatoria intestinal. Os gránulos de Ban-Lan-Gen (BLG) son unha coñecida formulación antiviral de MTC que exhibe unha potencial actividade antiinflamatoria no tratamento de diversas afeccións inflamatorias. Non obstante, o seu efecto antiinflamatorio sobre a colite e o seu mecanismo de acción aínda non están claros. MÉTODOS: Establecer a colite crónica recorrente inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS) en ratos. Realizáronse índices de actividade da enfermidade, marcadores histolóxicos de lesión e niveis de citocinas proinflamatorias para avaliar o efecto protector de BLG. Os efectos de BLG na microbiota intestinal e no intestino caracterizáronse polos niveis séricos de GLP-1 e a expresión colónica de Gcg, GPR41 e GRP43, a composición da microbiota intestinal, os niveis de SCFA fecais e a liberación de GLP-1 a partir de intestinos primarios. Produción de GLP-1 derivado de SCFA en células epiteliais do colon de rato. Resultados: o tratamento con BLG reduciu significativamente a perda de peso corporal, o DAI, o acurtamento do colon, o dano no tecido do colon e os niveis de citocinas proinflamatorias de TNF-α, IL-1β e IL-6 no tecido do colon. Ademais, o tratamento con BLG pode restaurar significativamente a expresión colónica de Gcg, GPR41 e GRP43 e os niveis séricos de GLP-1 en ratos con colite, e aumentando bacterias produtoras de SCFA como Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, e reducindo a abundancia de bacterias como Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas e Oscillibacter. Ademais, o tratamento con BLG pode aumentar significativamente o nivel de SCFA nas feces de ratos con colite. Ao mesmo tempo, os experimentos in vitro tamén demostraron que o extracto fecal de ratos tratados con BLG pode estimular en gran medida a segregación de GLP-1 por parte das células epiteliais do colon murinas primarias. Conclusións: Estes achados suxiren que o BLG ten un efecto anticolite. O BLG ten o potencial de desenvolverse como terapia, polo menos en parte modulando a microbiota intestinal e restaurando a produción intestinal de GLP-1 derivado de SCFA. Fármacos prometedores para a colite crónica recorrente. Palabras clave: colite, gránulos de Ban-Lan-Gen, microbiota intestinal, ácidos graxos de cadea curta, GLP-1.
A colite ulcerosa (CU) é unha enfermidade inflamatoria a longo prazo do colon e do recto caracterizada por diarrea recorrente, dor abdominal, perda de peso e feces sanguinolentas mucopurulentas.1 Recentemente, a prevalencia da CU aumentou en países con baixa incidencia, incluída a China, coa crecente popularidade dos estilos de vida occidentais.2 Este aumento supón importantes problemas para a saúde pública e ten serias implicacións para a capacidade de traballo e a calidade de vida dos pacientes. Cabe destacar que a patoxénese da CU segue sendo en gran parte descoñecida, pero xeralmente acéptase que a xenética, os factores ambientais, a microbiota intestinal e o sistema inmunitario contribúen ao desenvolvemento da CU.3 Mesmo agora, non existe cura para a CU e o obxectivo do tratamento é controlar clinicamente os síntomas clínicos, inducir e manter a remisión, promover a cicatrización da mucosa e reducir a recorrencia. Os tratamentos clásicos inclúen aminosalicilatos, corticosteroides, inmunosupresores e biolóxicos. Non obstante, estes fármacos non poden conseguir o efecto desexado debido aos seus diversos efectos secundarios.4 Recentemente, moitos estudos de caso demostraron que a medicina tradicional chinesa (MTC) mostrou un gran potencial para axudar para aliviar a CU con baixa toxicidade, o que suxire que o desenvolvemento de novas terapias de MTC é unha estratexia de tratamento prometedora para a CU.5-7
Os gránulos de Banlangen (BLG) son unha preparación da medicina tradicional chinesa elaborada a partir do extracto acuoso da raíz de Banlangen.8 Ademais da súa eficacia antiviral, o BLG presenta unha potencial actividade antiinflamatoria no tratamento de diversas afeccións inflamatorias.9,10 Ademais, illáronse e identificáronse glucosinolatos (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorrubina e glucósido a partir de extractos acuosos de Radix isatidis) e nucleósidos (hipoxantina, adenosina, uridina e guanosina) e alcaloides do índigo como o índigo e a indirrubina.11,12 Estudos previos documentaron ben que os compostos adenosina, uridina e indirrubina presentan potentes efectos anticolite en diferentes modelos animais de colite.13-17 Non obstante, non se realizaron estudos baseados na evidencia para avaliar a eficacia do BLG na colite. No presente estudo, investigamos o efecto protector do BLG sobre a colite crónica recorrente inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS) en ratos C57BL/6 e descubrimos que A administración oral de BLG atenuou significativamente a inflamación crónica recurrente inducida por DSS en ratos. Os seus mecanismos reguladores están asociados coa modulación da microbiota intestinal e a restauración da produción de péptido 1 similar ao glicagón (GLP-1) derivado do intestino.
Os gránulos de BLG (sen azucre, aprobados pola NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pequín, China; número de lote: 20110966) compráronse en farmacias. Os DSS (peso molecular: 36.000–50.000 daltons) compráronse a MP Biologicals (Santa Ana, EUA). A sulfasalazina (SASP) (≥ 98 % de pureza), a hematoxilina e a eosina compráronse a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Os kits de ensaio Elisa luminex para TNF-α, IL-1β e IL-6 de rato compráronse a R&D systems (Minneapolis, MN, EUA). O ácido acético, o ácido propiónico e o ácido butírico compráronse a Aladdin Industries (Shanghai, China). O ácido 2-etilbutírico comprouse a Merck KGaA (Darmstadt, Alemaña).
Adquiríronse ratos machos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (peso corporal 18-22 g) de Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pequín, China) e aloxáronse nun ambiente de 22 ± 2 °C cun ciclo de luz/escuridade de 12 h. Os ratos foron alimentados cunha dieta estándar de roedores con acceso libre a auga potable durante unha semana para aclimatarse ao novo ambiente. Os ratos foron entón divididos aleatoriamente en catro grupos: grupo de control, grupo modelo DSS, grupo tratado con SASP (200 mg/kg, oral) e grupo tratado con BLG (1 g/kg, oral). Como se mostra na Figura 1A, segundo o noso estudo anterior, a colite crónica recorrente experimental foi inducida en ratos mediante tres ciclos de DSS ao 1,8 % durante 5 días, seguidos de auga destilada durante 7 días, segundo o noso estudo anterior.18 Os ratos dos grupos tratados con SASP e BLG foron tratados con SASP e BLG, respectivamente, todos os días a partir do día 0. Segundo experimentos preliminares, a dose de A BLG fixouse en 1 g/kg. Mentres tanto, a dose de SASP fixouse en 200 mg/kg segundo a literatura.4 Os grupos de control e do modelo DSS recibiron o mesmo volume de auga durante todo o experimento.
Figura 1 A BLG mellora a colite crónica recorrente inducida por DSS en ratos. (A) Deseño experimental de colite crónica recorrente e tratamento, (B) cambio de peso corporal, (C) puntuación do índice de actividade da enfermidade (DAI), (D) lonxitude do colon, (E) imaxe representativa do colon, (F) tinción de H&E do colon (ampliación, ×100) e (G) puntuación histolóxica. Os datos preséntanse como media ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 fronte ao grupo de control (Con); *p < 0,05 ou **p < 0,01 ou ***p < 0,001 fronte ao grupo DSS.
O peso corporal, a consistencia das feces e a hemorraxia rectal rexistráronse diariamente. O índice de actividade da enfermidade (IAD) determinouse combinando as puntuacións de peso corporal, consistencia das feces e hemorraxia rectal como se describiu anteriormente.19 Ao final do experimento, todos os ratos foron sacrificados e recolléronse sangue, feces e colon para experimentos posteriores.
O tecido do colon fixouse en formalina e incluíuse en parafina. Realizáronse seccións de 5 micras que se tinguiron con hematoxilina-eosina (H&E), logo cegáronse e puntuáronse como se describiu previamente.19
O ARN total do tecido do colon extraeuse co reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California), seguido dunha extracción de ADNc con transcriptase inversa (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Xapón). A PCR cuantitativa realizouse empregando un sistema de PCR en tempo real con SYBR Green Master (Roche, Basilea, Suíza). Os transcritos do xene diana normalizáronse a β-actina e os datos analizáronse empregando o método 2-ΔΔCT. As secuencias dos cebadores xénicos móstranse na Táboa 1.
O illamento e cultivo primario de células epiteliais do colon de rato realizáronse como se describiu previamente.20 En resumo, os colons de ratos de 6 a 8 semanas de idade foron primeiro excisados ​​despois do sacrificio por dislocación cervical, logo abertos lonxitudinalmente, tratados con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, sen calcio nin magnesio) e cortados en anacos pequenos de 0,5-1 mm. Posteriormente, os tecidos foron dixeridos con 0,4 mg/mL de colagenase XI (Sigma, Poole, Reino Unido) en medio DMEM libre e centrifugados a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspende o precipitado en medio DMEM (complementado con soro fetal bovino ao 10 %, 100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina) a 37 °C e pásao a través dunha malla de nailon (tamaño de poro ~250 µm). Colocáronse alícuotas de células epiteliais do colon en placas con fondo de vidro e incubáronse con ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico e extractos fecais de rato para 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2.
O tecido do colon foi homoxeneizado con PBS e os niveis de citocinas IL-6, TNF-α e IL-1β no tecido do colon detectáronse empregando kits de ensaio ELISA luminex (R&D systems, Minneapolis, MN, EUA). Do mesmo xeito, os niveis de GLP-1 no soro e no medio de cultivo de células epiteliais do colon murinas primarias determináronse cun kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, China) segundo as instrucións do fabricante.
O ADN total das feces extraeuse cun kit de extracción de ADN (Tiangen, China). A calidade e a cantidade de ADN medíronse nas proporcións de 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm, respectivamente. Posteriormente, usando cada ADN extraído como molde, empregáronse os cebadores específicos 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) e 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) para amplificar as rexións V3-V4 do xene ARNr 16S en diferentes rexións. Os produtos de PCR purificáronse usando o kit de extracción en xel QIAquick (QIAGEN, Alemaña), cuantificáronse mediante PCR en tempo real e secuenciáronse usando a plataforma de secuenciación IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, EUA). Para a análise bioinformática, o procesamento de datos realizouse seguindo os protocolos descritos anteriormente.21,22 En resumo, use Cutadapt (V1.9.1) para filtrar ficheiros express brutos. As OTU agrupáronse usando UPARSE. (versión 7.0.1001) cun límite de semellanza do 97 %, e empregouse UCHIME para eliminar as secuencias quiméricas. A análise da composición e a clasificación da comunidade realizáronse mediante o clasificador RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) baseado na base de datos de xenes de ARN ribosómico SILVA.
Os niveis de ácidos graxos de cadea curta (ácido acético, ácido propiónico e ácido butírico) medíronse como se describiu previamente por Tao et al., con algunhas modificacións.23 En resumo, suspendéronse primeiro 100 mg de feces en 0,4 mL de auga desionizada, seguido de 0,1 mL de ácido sulfúrico ao 50 % e 0,5 mL de ácido 2-etilbutírico (estándar interno), logo homoxeneizáronse e quentáronse a 4 °C. Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 minutos a C. O sobrenadante extraeuse con 0,5 mL de éter e inxectouse no GC para a súa análise. Para a análise por cromatografía de gases (GC), as mostras analizáronse cun cromatógrafo de gases GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) equipado cun detector de ionización de chama (FID). A separación conseguiuse usando unha columna ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., China). Os datos adquiríronse usando o software de solucións GC (Shimadzu, Inc.). A proporción de división foi de 10:1, o gas portador foi nitróxeno e o caudal foi de 6 mL/min. O volume de inxección foi de 1 μL. A temperatura do inxector e do detector foi de 300 °C. A temperatura do forno mantívose a 140 °C durante 13,5 minutos e despois aumentouse a 250 °C a unha velocidade de 120 °C/min; a temperatura mantívose durante 5 minutos.
Os datos preséntanse como media ± erro estándar da media (SEM). A significación dos datos avaliouse mediante ANOVA unidireccional seguida da proba de rango múltiple de Duncan. Para todos os cálculos utilizouse o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) e considerouse estatisticamente significativo un valor de p < 0,05.
É ben sabido que a colite recurrente é unha enfermidade colítica crónica recurrente con dor abdominal intensa, diarrea e hemorraxia. Polo tanto, estableceuse a colite crónica recurrente inducida por DSS en ratos para avaliar a eficacia anticolite da BLG (Fig. 1A). En comparación co grupo de control, os ratos do grupo modelo DSS tiñan un peso corporal significativamente reducido e un DAI máis alto, e estes cambios revertéronse significativamente despois de 24 días de tratamento con BLG (Figura 1B e C). O acurtamento do colon é unha característica importante da CU. Como se mostra nas Figuras 1D e E, a lonxitude do colon dos ratos que recibiron DSS acurtouse significativamente, pero aliviouse co tratamento con BLG. Posteriormente, realizouse unha análise histopatolóxica para avaliar a inflamación colónica. As imaxes tinguidas con H&E e as puntuacións patolóxicas mostraron que a administración de DSS interrompeu significativamente a arquitectura colónica e provocou a destrución das criptas, mentres que o tratamento con BLG reduciu significativamente a destrución das criptas e as puntuacións patolóxicas (Figura 1F e G). En particular, o efecto protector da BLG a unha dose de 1 g/kg foi comparable ao da SASP a un dose de 200 mg/kg. Conxuntamente, estes achados suxiren que a BLG é eficaz para reducir a gravidade da colite crónica recorrente inducida por DSS en ratos.
O TNF-α, o IL-1β e o IL-6 son importantes marcadores inflamatorios da inflamación do colon. Como se mostra na Figura 2A, o DSS induciu un aumento significativo na expresión xénica do TNF-α, o IL-1β e o IL-6 no colon en comparación co grupo de control. A administración de BLG pode reverter significativamente estes cambios mediados polo DSS. A continuación, empregamos ELISA para determinar os niveis das citocinas inflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 no tecido do colon. Os resultados tamén mostraron que os niveis colónicos de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumentaron significativamente nos ratos tratados con DSS, mentres que o tratamento con BLG aliviou estes aumentos (Figura 2B).
Figura 2 A BLG inhibe a expresión xénica e a produción das citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 no colon de ratos tratados con DSS. (A) Expresión xénica colónica de TNF-α, IL-1β e IL-6; (B) niveis de proteína colónica de TNF-α, IL-1β e IL-6. Os datos preséntanse como media ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 fronte ao grupo de control (Con); *p < 0,05 ou **p < 0,01 fronte ao grupo DSS.
A disbiose intestinal é fundamental na patoxénese da CU.24 Para investigar se a BLG modula a microbiota intestinal dos ratos tratados con DSS, realizouse a secuenciación do ARNr 16S para analizar a comunidade bacteriana do contido intestinal. O diagrama de Venn mostra que os tres grupos comparten 385 OTU. Ao mesmo tempo, cada grupo tiña OTU únicas (Fig. 3A). Ademais, o índice Chao1 e o índice Shannon que se mostran nas Figuras 3B e C mostraron que a diversidade da comunidade da microbiota intestinal reduciuse nos ratos tratados con BLG, xa que o índice Shannon diminuíu significativamente no grupo tratado con BLG. A análise de compoñentes principais (PCA) e a análise de coordenadas principais (PCoA) utilizáronse para determinar os patróns de agrupamento entre os tres grupos e mostraron que a estrutura da comunidade dos ratos tratados con DSS estaba claramente separada despois do tratamento con BLG (Figuras 3D e E). Estes datos suxiren que o tratamento con BLG afectou significativamente a estrutura da comunidade dos ratos con colite inducida por DSS.
Figura 3 A BLG altera a diversidade da microbiota intestinal en ratos con colite inducida por DSS. (A) Diagrama de Venn da OTU, (B) Índice de Chao1, (C) Índice de riqueza de Shannon, (D) Gráfica de puntuación da análise de compoñentes principais (PCA) da OTU, (E) Figura de puntuación da análise de coordenadas principais (PCoA) da OTU. Os datos preséntanse como media ± SEM (n = 6). **p < 0,01 fronte ao grupo DSS.
Para avaliar os cambios específicos na microbiota fecal, analizamos a composición da microbiota intestinal a todos os niveis taxonómicos. Como se mostra na Figura 4A, os principais filos en todos os grupos foron Firmicutes e Bacteroidetes, seguidos de Verrucomicrobia. As abundancias relativas de Firmicutes e as proporcións Firmicutes/Bacteroidetes aumentaron significativamente nas comunidades microbianas fecais dos ratos tratados con DSS en comparación cos ratos de control, e estes cambios inverteronse significativamente despois do tratamento con BLG. En particular, o tratamento con BLG aumentou significativamente a abundancia relativa de Verrucobacterium nas feces dos ratos con colite inducida por DSS. A nivel familiar, as comunidades microbianas fecais estaban ocupadas por Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae e Prevotellaceae (Fig. 4B). En comparación co grupo DSS, o esgotamento de BLG aumentou a abundancia de Akkermansiaceae, pero diminuíu a abundancia de Lachnospiraceae e Ruminococcaceae. En particular, a nivel de xénero, as feces... a microbiota estaba ocupada polo grupo Lachnospira_NK4A136, Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Este achado tamén demostrou que o tratamento con BLG reverteu eficazmente o desequilibrio da microbiota en resposta á exposición aos DSS, caracterizado por unha diminución do grupo Eubacterium_xylanophilum, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas e Oscillibacter, e un aumento de Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4 A BLG altera a abundancia da microbiota intestinal en ratos con colite inducida por DSS. (A) Abundancia de microbiota intestinal a nivel de filo; (B) Abundancia de microbiota intestinal a nivel de familia; (C) Abundancia de microbiota intestinal a nivel de xénero. Os datos preséntanse como media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 ou ###p < 0,001 fronte ao grupo de control (Con); *p < 0,05 ou **p < 0,01 ou ***p < 0,001 fronte ao grupo DSS.
Tendo en conta que os ácidos graxos de cadea curta (AGCC) son os principais metabolitos de Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, mentres que o acetato, o propionato e o butirato son os AGCC máis abundantes na luz intestinal,25-27 aínda estamos no noso estudo. Como se mostra na Figura 5, as concentracións de acetato, propionato e butirato fecal reducíronse significativamente no grupo tratado con DSS, mentres que o tratamento con BLG puido suprimir en gran medida esta redución.
Figura 5. O BLG aumenta os niveis de AGCC nas feces de ratos con colite inducida por DSS. (A) Contido de ácido acético nas feces; (B) contido de ácido propiónico nas feces; (C) contido de ácido butírico nas feces. Os datos preséntanse como media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 fronte ao grupo de control (Con); *p < 0,05 ou **p < 0,01 fronte ao grupo DSS.
Ademais, calculamos o coeficiente de correlación de Pearson entre os AGCC diferenciais a nivel de xénero e a microbiota fecal. Como se mostra na Figura 6, Akkermansia correlacionouse positivamente coa produción de ácido propiónico (Pearson = 0,4866) e ácido butírico (Pearson = 0,6192). Pola contra, tanto Enteromonas como Oscillobacter asociáronse negativamente coa produción de acetato, con coeficientes de Pearson de 0,4709 e 0,5104, respectivamente. Do mesmo xeito, Ruminococcaceae_UCG-014 correlacionouse negativamente coa produción de ácido propiónico (Pearson = 0,4508) e ácido butírico (Pearson = 0,5842), respectivamente.
Figura 6 Análise de correlación de Pearson entre AGCC diferenciais e microbios do colon. (A) Enteromonas con ácido acético; (B) Bacilo de conmoción cerebral con ácido acético; (C) Akkermansia vs ácido propiónico; (D) Ruminococcus_UCG-014 con ácido propiónico; (E) Akkermansia con ácido butírico; (F) Ruminococcus_UCG-014 con ácido butírico.
O péptido-1 similar ao glucagón (GLP-1) é un produto postraducional específico do tipo celular do proglucagón (Gcg) con propiedades antiinflamatorias.28 Como se mostra na Figura 7, o DSS induciu unha diminución significativa na expresión do ARNm de Gcg. O tratamento con colon e BLG puido reverter significativamente a redución de Gcg inducida por DSS en comparación co grupo de control (Fig. 7A). Ao mesmo tempo, o nivel de GLP-1 no soro reduciuse significativamente no grupo tratado con DSS, e o tratamento con BLG puido previr en gran medida esta redución (Fig. 7B). Dado que os ácidos graxos de cadea curta poden estimular a secreción de GLP-1 a través da activación do receptor 43 acoplado á proteína G (GRP43) e do receptor 41 acoplado á proteína G (GRP41), tamén examinamos GPR41 e GRP43 no colon de ratos con colite e descubrimos que a expresión do ARNm colónico de GRP43 e GPR41 diminuíu significativamente despois da exposición a DSS, e o tratamento con BLG puido rescatar eficazmente estas diminucións (Figura 7C e D).
Figura 7 O BLG aumenta os niveis séricos de GLP-1 e a expresión do ARNm de Gcg, GPR41 e GRP43 no colon en ratos tratados con DSS. (A) Expresión do ARNm de Gcg no tecido do colon; (B) Nivel de GLP-1 no soro; (C) Expresión do ARNm de GPR41 no tecido do colon; (D) Expresión do ARNm de GPR43 no tecido do colon. Os datos preséntanse como media ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 fronte ao grupo de control (Con); *p < 0,05 fronte ao grupo DSS.
Dado que o tratamento con BLG podería aumentar os niveis séricos de GLP-1, a expresión do ARNm de Gcg no colon e os niveis de AGCC fecais en ratos tratados con DSS, examinamos máis a fondo o acetato, o propionato e o butirato, así como os ratos de control (F-Con), colite DSS (F-Con) (DSS) e colite tratados con BLG (F-BLG), sobre a liberación de GLP-1 das células epiteliais do colon murinas primarias. Como se mostra na Figura 8A, as células epiteliais do colon murinas primarias de rato tratadas con 2 mM de ácido acético, ácido propiónico e ácido butírico, respectivamente, estimularon significativamente a liberación de GLP-1, o que coincide con estudos previos.29,30 Do mesmo xeito, todos os F-Con, F-DSS e F-BLG (equivalentes a 0,25 g de feces) estimularon en gran medida a liberación de GLP-1 das células epiteliais do colon murinas primarias. Cabe destacar que a cantidade de GLP-1 liberada polas células epiteliais do colon murinas primarias de rato tratadas con F-DSS foi moito menor que a das células epiteliais do colon murinas primarias tratadas con F-Con e F-BLG. células epiteliais do colon de rato (Figura 8B). Estes datos suxiren que o tratamento con BLG restaurou significativamente a produción de GLP-1 derivado de SCFA intestinal.
Figura 8 O SCFA derivado de BLG estimula a liberación de GLP-1 das células epiteliais primarias do colon murino. (A) O ácido acético, o ácido propiónico e o ácido butírico estimularon a liberación de GLP-1 das células epiteliais primarias do colon murino; (B) Os extractos fecais F-Con, F-DSS e F-BLG estimularon as células epiteliais primarias do colon murino. Cantidade de GLP-1 liberado. Colocáronse alícuotas de células epiteliais do colon en placas de Petri con fondo de vidro e tratáronse con ácido acético 2 mM, ácido propiónico, ácido butírico e extractos fecais F-Con, F-DSS e F-BLG (equivalente a 0,25 g de feces), respectivamente. 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2, respectivamente. A cantidade de GLP-1 liberada a partir de células epiteliais primarias do colon murino detectouse mediante ELISA. Os datos preséntanse como media ± SEM (n = 3). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 fronte ao branco ou F-Con; *p < 0,05 fronte a F-DSS.
Abreviaturas: Ace, ácido acético; Pro, ácido propiónico; porén, ácido butírico; F-Con, extracto fecal de ratos de control; F-DSS, extracto fecal de ratos con colite; F-BLG, de colon tratado con BLG. Extractos fecais de ratos inflamatorios.
Clasificada pola Organización Mundial da Saúde como enfermidade refractaria, a CU está a converterse nun perigo mundial; Non obstante, os métodos eficaces para predicir, previr e tratar a enfermidade aínda son limitados. Polo tanto, existe unha necesidade urxente de explorar e desenvolver novas estratexias terapéuticas seguras e eficaces para a CU. As preparacións da medicina tradicional chinesa son unha opción prometedora porque moitas preparacións da medicina tradicional chinesa demostraron ser eficaces no tratamento da CU na poboación chinesa ao longo dos séculos, e todas son biolóxicos orgánicos e materiais naturais que son na súa maioría inofensivos para os humanos e os animais.31,32 Este estudo tivo como obxectivo buscar unha preparación da medicina tradicional chinesa segura e eficaz para o tratamento da CU e explorar o seu mecanismo de acción. A BLG é unha coñecida fórmula de herbas chinesas que se usa para tratar a gripe.8,33 O traballo no noso laboratorio e noutros demostrou que o índigo, un produto da medicina tradicional chinesa procesado da mesma materia prima que a BLG, presenta unha eficacia significativa no tratamento da CU en humanos e animais.4,34 Non obstante, os efectos anticolite da BLG e os seus efectos O mecanismo non está claro. No estudo actual, os nosos resultados demostran que a BLG atenúa eficazmente a inflamación colónica inducida por DSS, que está asociada coa modulación da microbiota intestinal e restauración da produción de GLP-1 derivada do intestino.
É ben sabido que a CU se caracteriza por períodos recurrentes con características clínicas típicas, como perda de peso, diarrea, hemorraxia rectal e danos extensos na mucosa do colon.35 Polo tanto, a colite crónica recurrente administrouse mediante tres ciclos de DSS ao 1,8 % durante cinco días, seguidos de sete días de auga potable. Como se mostra na Figura 1B, a perda de peso fluctuante e as puntuacións DAI indicaron unha indución exitosa da colite crónica recurrente. Os ratos do grupo tratado con BLG mostraron unha recuperación ascendente a partir do día 8, que foi significativamente diferente do día 24. Os mesmos cambios tamén se observaron na puntuación DAI, o que suxire unha mellora na mellora clínica da colite. En termos de lesións no colon e estado inflamatorio, a lonxitude do colon, o dano no tecido do colon e a expresión xénica e a produción das citocinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 no tecido do colon tamén melloraron moito despois do tratamento con BLG. Conxuntamente, estes resultados demostran claramente que BLG é eficaz no tratamento da colite crónica recurrente en ratos.
Como exerce a BLG os seus efectos farmacolóxicos? Numerosos estudos previos demostraron que a microbiota intestinal xoga un papel fundamental na patoxénese da CU, e as terapias baseadas no microbioma e dirixidas ao microbioma xurdiron como unha estratexia moi atractiva para o tratamento da CU. No presente estudo, demostramos que o tratamento con BLG provocou cambios significativos na composición da microbiota intestinal, o que suxire que o efecto protector da BLG contra a colite inducida por DSS está relacionado coa modulación da microbiota intestinal. Esta observación é consistente coa idea de que a reprogramación da homeostase da microbiota intestinal é unha abordaxe importante para comprender a eficacia das preparacións de MTC.36,37 Cabe destacar que a Akkermansia é unha bacteria gramnegativa e estritamente anaeróbica que vive na capa de moco do intestino, que degrada as mucinas, produce ácido propiónico, estimula a diferenciación das células caliciformes e mantén a función da mucosa da integridade da barreira.26 Múltiples datos clínicos e animais suxiren que a Akkermansia está altamente asociada cunha mucosa sa,38 e a administración oral de Akkermansia spp. pode mellorar significativamente a inflamación da mucosa.39 Os nosos datos actuais suxiren que a abundancia relativa de Akkermansia aumenta significativamente despois do tratamento con BLG. Ademais, Prevotellaceae_UCG-001 é unha bacteria produtora de AGCC.27 Múltiples estudos demostraron que Prevotellaceae_UCG-001 atopábase en baixa abundancia relativa nas feces de animais con colite.40,41 Os nosos datos actuais tamén mostran que o tratamento con BLG pode aumentar significativamente a abundancia relativa de Prevotellaceae_UCG-001 no colon de ratos tratados con DSS. En contraste, Oscillibacter é unha bacteria mesófila e estritamente anaeróbica.42 informou de que a abundancia relativa de Oscillibacter aumentou significativamente en ratos con UC e estaba significativamente correlacionada positivamente cos niveis de IL-6 e IL-1β e as puntuacións patolóxicas.43,44 En particular, o tratamento con BLG reduciu significativamente a abundancia relativa de Oscillibacter nas feces de ratos tratados con DSS. En particular, estas bacterias alteradas con BLG foron as bacterias que máis AGCC produciron. Numerosos estudos previos demostraron o potencial beneficioso efectos dos AGCC na inflamación colónica e na protección da integridade epitelial intestinal.45,46 Os nosos datos actuais tamén observaron que as concentracións de acetato, propionato e butirato de AGCC nas feces tratadas con DSS aumentaron considerablemente nos ratos tratados con BLG. En conxunto, estes achados demostran claramente que o tratamento con BLG pode potenciar eficazmente as bacterias produtoras de AGCC inducidas por DSS en ratos con colite crónica recorrente.
O GLP-1 é unha incretina producida principalmente no íleo e no colon e desempeña un papel importante no atraso do baleirado gástrico e na redución da glicosa no sangue posprandial.47 As evidencias suxiren que a dipeptidil peptidase (DPP)-4, un agonista do receptor do GLP-1 e unha nanomedicina do GLP-1, poden aliviar eficazmente a inflamación intestinal en ratos.48-51 Como se informou en estudos previos, as concentracións elevadas de AGCC asociáronse cos niveis plasmáticos de GLP-1 en humanos e ratos.52 Os nosos datos actuais mostran que despois do tratamento con BLG, os niveis séricos de GLP-1 e a expresión do ARNm de Gcg aumentaron significativamente. Do mesmo xeito, a secreción de GLP-1 aumentou significativamente nos cultivos colónicos despois da estimulación con extractos fecais de ratos con colite tratados con BLG en comparación coa estimulación con extractos fecais de ratos con colite tratados con DSS. Como afectan os AGCC á liberación de GLP-1? Gwen Tolhurst et al. informou de que os SCFA poden estimular a secreción de GLP-1 a través de GRP43 e GPR41.29 Os nosos datos actuais tamén mostran que o tratamento con BLG aumenta significativamente a expresión de ARNm de GRP43 e GPR41 no colon de ratos tratados con DSS. Estes datos suxiren que o tratamento con BLG pode restaurar a produción de GLP-1 promovida por SCFA mediante a activación de GRP43 e GPR41.
O BLG é un medicamento de venda libre (OTC) a longo prazo na China. A dose máxima tolerada de BLG en ratos Kunming é de 80 g/kg e non se observou toxicidade aguda.53 Actualmente, a dose recomendada de BLG (sen azucre) en humanos é de 9-15 g/día (3 veces ao día). O noso estudo mostrou que o BLG a 1 g/kg mellorou a colite crónica recorrente inducida por DSS en ratos. Esta dose é próxima á dose de BLG utilizada clinicamente. O noso estudo tamén descubriu que o seu mecanismo de acción está mediado, polo menos en parte, por alteracións na microbiota intestinal, concretamente bacterias produtoras de AGCC, como Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, para restaurar a produción de GLP-1 derivada do intestino. Estes achados suxiren que o BLG merece unha maior consideración como un posible axente terapéutico para o tratamento clínico da colite. Non obstante, o mecanismo exacto polo que modula a microbiota intestinal aínda debe ser confirmado por ratos con deficiencia de microbiota e transplante de bacterias fecais.
Ás, ácido acético; butácido, ácido butírico; BLG, pandano; DSS, sulfato sódico de dextrano; DAI, índice de actividade da enfermidade; DPP, dipeptidil peptidase; FID, detector de ionización de chama; F-Con, control Extractos fecais de ratos; F-DSS, extractos fecais de ratos con colite DSS; F-BLG, extractos fecais de ratos con colite tratados con BLG; GLP-1, péptido similar ao glicagón-1; Gcg, glicagón; cromatografía de gases, cromatografía de gases; GRP43, receptor 43 acoplado á proteína G; GRP41, receptor 41 acoplado á proteína G; H&E, hematoxilina-eosina; HBSS, solución salina equilibrada de Hanks; OTC, OTC; PCA, análise de compoñentes principais; PCoA, análise de coordenadas principais; Pro, ácido propiónico; SASP, sulfasalazina; AGCC, ácidos graxos de cadea curta; medicina chinesa, medicina tradicional chinesa; CU, colite ulcerosa.
Todos os protocolos experimentais foron aprobados polo Comité de Ética Animal do Centro Médico da Universidade de Ciencia e Tecnoloxía da Universidade de Pequín Shenzhen-Hong Kong (Shenzhen, China) segundo as Directrices Institucionais e o Regulamento Animal (número de ética A2020157).
Todos os autores fixeron contribucións significativas á concepción e deseño, á adquisición de datos ou á análise e interpretación de datos; participaron na redacción do artigo ou na revisión critica de contido intelectual importante; acordaron enviar o manuscrito á revista actual; aprobaron finalmente a versión para a súa publicación; foron responsables de todos os aspectos do traballo.
Este traballo contou co apoio da Fundación Nacional de Ciencias Naturais da China (81560676 e 81660479), o proxecto de primeira clase da Universidade de Shenzhen (86000000210), o Fondo do Comité de Innovación Científica e Tecnolóxica de Shenzhen (JCYJ20210324093810026), o Fondo de Investigación Médica en Ciencia e Tecnoloxía da Provincia de Guangdong (A2020157 e A2020272), a Farmacia da Universidade Médica de Guizhou da provincia de Guizhou, financiada por Key Laboratory (YWZJ2020-01) e o Hospital Universitario de Shenzhen de Pequín (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Potencial terapéutico do triptólido como axente antiinflamatorio na colite experimental inducida por sulfato de sodio de dextrano en ratos. pre-immune. 2020;11:592084. doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. A carga global da enfermidade inflamatoria intestinal: de 2015 a 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue e outros. Alcaloides derivados de plantas: modificadores prometedores da enfermidade na enfermidade inflamatoria intestinal. Prepharmacology. 2019;10:351. doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B e outros. Indigo Naturalis inhibe o estrés oxidativo colónico e as respostas Th1/Th17 na colite inducida por DSS en ratos. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Eficacia e seguridade da Sophora flavescens (Sophora flavescens) medicina herbal chinesa no tratamento da colite ulcerosa: evidencia clínica e posibles mecanismos. Prepharmacology. 2020; 11: 603476. doi: 10.3389 / fphar. 2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Produtos naturais: fármacos experimentalmente eficaces para o tratamento da enfermidade inflamatoria intestinal. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Reflexións sobre o tratamento adxuvante da colite ulcerosa con medicina tradicional chinesa. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT e outros. Eficacia e seguridade dos gránulos de Banlangen no tratamento da gripe estacional: protocolo de estudo para un ensaio controlado aleatorizado. trial. 2015; 16: 126. doi: 10.1186/s13063-015-0645-x