A clasificación de proteínas na vía secretora é esencial para manter a compartimentación celular e a homeostase. Ademais da clasificación mediada pola cuncha, o papel dos lípidos na clasificación de cinesinas no proceso de transporte secretor é unha cuestión básica de longa data que aínda non se respondeu. Aquí, realizamos imaxes 3D simultáneas multicolores de alta resolución en tempo real para demostrar in vivo que as proteínas inmobilizadas con glicosilfosfatidilinositol recentemente sintetizadas con restos lipídicos de ceramida moi longos están agrupadas e clasificadas en sitios de saída netos de endoplasmas especializados, que son diferentes dos utilizados polas proteínas transmembrana. Ademais, mostramos que a lonxitude da cadea de ceramida na membrana do retículo endoplasmático é fundamental para esta selectividade de clasificación. O noso estudo proporciona a primeira evidencia directa in vivo para clasificar as cargas de proteínas en función da lonxitude da cadea lipídica en sitios de exportación selectivos na vía secretora.
Nas células eucariotas, as proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático (RE) clasifícanse durante o transporte a través da vía secretora para a súa entrega ao seu destino celular axeitado (1). Ademais da clasificación mediada pola cuberta, especulouse durante moito tempo que certos lípidos tamén poden servir como puntos de saída selectivos agrupándoos en dominios de membrana específicos para proteínas específicas (2-5). Non obstante, aínda hai unha falta de evidencia directa in vivo para demostrar este posible mecanismo baseado en lípidos. Para resolver este problema básico, estudamos en lévedos como as proteínas ancoradas en glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) se exportan diferencialmente desde o RE. As GPI-AP son unha variedade de proteínas da superficie celular conectadas a lípidos (6, 7). A GPI-AP é unha proteína secretada unida ás capas externas da membrana plasmática a través da porción glicolipídica (áncora GPI). Aceptan áncoras GPI como modificacións postraducionais conservadoras no lumen do RE (8). Despois da unión, a GPI-AP pasa a través do aparato de Golgi (5, 9) desde o RE ata a membrana plasmática. A presenza de áncoras GPI fai que a GPI-AP sexa transportada por separado das proteínas secretadas transmembrana (incluídas outras proteínas da membrana plasmática) ao longo da vía secretora (5, 9, 10). Nas células de lévedo, as GPI-AP sepáranse doutras proteínas secretadas no retículo endoplasmático e logo empaquetanse en vesículas únicas envoltas polo complexo proteico de cuberta II (COPII) (6, 7). Os determinantes deste proceso de clasificación no proceso de exportación do RE non están claros, pero especúlase que este mecanismo pode requirir lípidos, especialmente a remodelación estrutural da porción lipídica da áncora GPI (5, 8). Nos lévedos, a remodelación dos lípidos do GPI comeza inmediatamente despois de que o GPI se una e, en moitos casos, fai que a ceramida se una ao ácido graxo saturado de cadea longa de 26 carbonos (C26:0) (11, 12). A ceramida C26 é a principal ceramida producida polas células de lévedo ata o de agora. Sintetízase no RE e a maior parte expórtase ao aparato de Golgi a través de vesículas COPII (13). A exportación de GPI-AP ao RE require especificamente a síntese continua de ceramida (14, 15) e, á súa vez, a conversión da ceramida a ceramida de inositol fosfato (IPC) no aparato de Golgi depende da síntese de áncora GPI (16). Os estudos biofísicos con membranas artificiais demostraron que as ceramidas de cadea acilo moi longa poden coalescer para formar dominios ordenados con propiedades físicas únicas (17, 18). Estes datos levan á hipótese de que a ceramida C26 e a GPI-AP coa ceramida C26 usan as súas propiedades físicas para coalescer en rexións ordenadas ou rexións no ambiente lipídico da membrana do RE relativamente desordenado. Está composta principalmente por glicerolípidos curtos e insaturados (C16:1 e C18:1) (19, 20). Estas rexións centraranse selectivamente en sitios de saída do RE (Research Reactional Endoplasmic Saída, ERES) específicos, onde a ceramida e a GPI-AP baseada en ceramida poden cotransportarse ao aparato de Golgi na mesma vesícula COPII dedicada (5).
Neste estudo, probamos directamente este mecanismo baseado en lípidos mediante microscopía confocal de imaxe en tempo real de superresolución (SCLIM), que é unha técnica de microscopía de vangarda que pode observar simultaneamente proteínas marcadas con fluorescencia. As imaxes tricolores e tridimensionais (3D) teñen unha resolución e velocidade extremadamente altas en células vivas (21, 22).
Primeiro aplicamos a tecnoloxía SCLIM para definir mellor como se cribaba a GPI-AP normal co grupo ceramida C26 a partir de proteínas segregadas transmembrana despois de saír do RE en S. cerevisiae. Para comprobar a clasificación do RE, empregamos un sistema xenético que pode visualizar directamente a carga recentemente sintetizada que entra no RE in vivo (7, 23). Como carga, escollemos a GPI-AP Gas1 baseada en ceramida C26 marcada con proteína fluorescente verde (GFP) e a proteína fluorescente transmembrana Mid2 marcada con proteína fluorescente no infravermello próximo (iRFP), ambas dirixidas á membrana plasmática (24-26). No mutante sensible á temperatura sec31-1, estas dúas cargas exprésanse baixo un promotor inducible por galactosa e un marcador ERES constitutivo. Á temperatura extrema (37 °C), debido a que a mutación sec31-1 afecta á función do compoñente da cuberta de COPII Sec31 para inhibir a xerminación de COPII e a exportación do RE, a carga recentemente sintetizada acumúlase no RE (23). Despois de arrefriar a baixa temperatura (24 °C), as células mutantes sec31-1 recuperáronse da área secretora e a nova carga sintética acumulada comezou a ser exportada desde o RE. A visualización CLIM mostrou que a maior parte do Gas1-GFP e Mid2-iRFP recentemente sintetizados aínda se acumulaba no RE das células mutantes sec31-1 despois da incubación a 37 °C e logo se liberaba a 24 °C durante 5 minutos (Figura 1). Dado que Mid2-iRFP se distribúe por toda a membrana do RE e Gas1-GFP está concentrado e recollido na área descontinua da membrana do RE, a súa distribución é completamente diferente (Figura 1, A a C e Película S1). Ademais, como se mostra na Figura 1D, o clúster Gas1-GFP non ten Mid2-iRFP. Estes resultados indican que as proteínas GPI-AP e transmembrana se separaron cedo en diferentes rexións da membrana do RE. O clúster Gas1-GFP está adxacente a un ERES específico marcado coa proteína de recubrimento COPII Sec13 de mCherry (Figura 1, E e F, e película S1) (23).
As células sec31-1 expresan secrecións inducidas por galactosa, unha ceramida de cadea longa acílica (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e a proteína transmembrana Mid2-iRFP (TMP, azul), e este etiquetado ERES construtivo Sec13-mCherry (ERES, maxenta) incubouse a 37 °C durante 30 minutos, moveuse a 24 °C e obtívose imaxes mediante SCLIM 5 minutos despois. (A a C) mostra unha imaxe 2D fusionada ou única representativa dun plano (A), unha imaxe de proxección 2D de 10 seccións z (B) ou unha imaxe 3D dun hemisferio celular da carga e os marcadores ERES (C). Barra de escala de 1 μm (A e B). A unidade de escala é de 0,551 μm (C). Gas1-GFP detectouse en rexións ou clústeres discretos do RE, mentres que Mid2-iRFP detectouse e distribuíuse por toda a membrana do RE (C). (D) O gráfico mostra a intensidade relativa de fluorescencia de Gas1-GFP e Mid2-iRFP no clúster Gas1-GFP ao longo da liña de frecha branca (esquerda). AU, unidade arbitraria. (E e F) representan a imaxe 3D que combina a marca goods e ERES. Detectáronse clústeres Gas1-GFP preto do ERES específico. A unidade de escala é de 0,551 μm. (F) A frecha branca sólida marca o clúster Gas1-GFP asociado con ERES. Os paneis central e dereito mostran a imaxe 3D ampliada fusionada e unha vista rotada do clúster Gas1-GFP seleccionado.
A estreita relación espacial entre o clúster Gas1-GFP e un ERES específico indica que Gas1-GFP pode entrar nun ERES selectivo, o que é diferente da selectividade utilizada por Mid2-iRFP para saír do RE. Para abordar esta posibilidade, cuantificamos a proporción de ERES para só unha ou dúas mercadorías (Figura 2, A a C). Descubrimos que a maioría dos ERES (70 %) conteñen só un tipo de carga. A imaxe inferior da Figura 2C mostra dous exemplos típicos de ERES con só Gas1-GFP (Figura 1) ou só Mid2-iRFP (Figura 2). En contraste, aproximadamente o 20 % dos ERES conteñen dúas cargas que se solapan na mesma área. Descubriuse que algúns ERES (10 %) contiñan dous tipos de carga, pero estaban illados en áreas claramente diferentes. Polo tanto, esta análise estatística mostra que, despois de exportar o RE, GPI-AP Gas1-GFP e a carga transmembrana Mid2-iRFP divídense en diferentes ERES (Figura 2D). Esta eficiencia de clasificación é moi consistente coa análise bioquímica (6) e a determinación morfolóxica (7) previas. Tamén podemos observar o comportamento da carga en corentena que entra no ERES (Figura 2E e Película S2). A Figura 2E mostra que só unha pequena porción de Gas1-GFP (panel 3) ou Mid2-iRFP (panel 4) entra no ERES por un lado e está confinada nunha área discreta. O Panel 5 da Figura 2E mostra que Gas1-GFP e Mid2-iRFP ás veces atópanse no mesmo ERES, pero entran por lados diferentes e concéntranse en rexións separadas que poden representar diferentes vesículas de COPII. Tamén confirmamos que a separación e clasificación observada de GPI-AP Gas1 baseada en ceramida C26 como ERES selectivo é específica porque outra carga de secreción transmembrana, a proteína da membrana plasmática Axl2 (27) etiquetada con GFP, mostra un comportamento similar ao de Mid2-iRFP. (Imaxe S1 e Película S3). A Axl2-GFP recentemente sintetizada distribúese a través da membrana do RE como Mid2-iRFP (Figura S1, A e B) e está colocalizada con Mid2-iRFP na maioría dos ERES (Figura S1, B a D). Os paneis 1 e 2 da Figura 1. S1C mostran dous exemplos típicos de ERES onde dúas cargas transmembrana se solapan. Nestes casos, ambas as mercadorías entran xuntas no ERES (Figura S1E, Panel 3 e Película S3).
As células sec31-1 que expresan secrecións inducibles por galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, azul) e o marcado constitutivo de ERES Sec13-mCherry (ERES, maxenta) colocáronse a 37 °C. Despois de incubar durante 30 minutos a °C, móvese a 24 °C para liberar o bloque de secreción e obtén a imaxe con SCLIM despois de 20 minutos. (A a C) Imaxes de proxección 2D representativas (A; barra de escala, 1 μm) ou imaxes de hemisferio celular 3D (B e C; unidade de escala, 0,456 μm) da carga e 10 seccións z marcadas con ERES. O panel inferior en (B) e o panel en (C) mostran imaxes procesadas para mostrar só as mercadorías presentes en ERES (maxenta) [Gas1-GFP (gris) e Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Frecha aberta: ERES só transporta unha peza de carga (1 a 4). Frecha gris: o ERES contén carga segregada (5). Frecha branca sólida: o ERES contén carga colocalizada. Abaixo: o ERES único seleccionado contén só Gas1-GFP (1) ou Mid2-iRFP (2). Barra de escala, 100 nm. (D) Cuantificación da microfotografía descrita en (C). A porcentaxe media de ERES que contén só unha carga (Gas1-GFP ou Mid2-iRFP), carga segregada e carga superposta. En tres experimentos independentes, n=432 en 54 celas. Barra de erro = SD. Proba t non pareada de dúas colas. *** P = 0,0002. (E) Imaxe 3D do ERES seleccionado de carga en corentena marcada con (C). Gas1-GFP (verde) (3) ou Mid2-iRFP (azul) (4) entra no ERES (maxenta) por un lado e está restrinxido a unha pequena área dentro do ERES. Ás veces, ambos tipos de carga entran no mesmo ERES (5) polo mesmo lado e quedan confinados a unha zona illada dentro do ERES. Barra de escala, 100 nm.
A continuación, probamos a hipótese de que a ceramida de cadea acilica longa (C26) presente na membrana do RE impulsa a agrupación e clasificación específicas de Gas1 en ERES selectivos. Para este fin, empregamos unha cepa de lévedo modificada GhLag1, na que as dúas ceramida sintases endóxenas Lag1 e Lac1 foron substituídas por GhLag1 (o homólogo Lag1 do algodón), o que resultou nunha cepa de lévedo cunha cepa de ceramida na membrana celular máis curta que a do tipo salvaxe (Figura 3A) (28). A análise de espectrometría de masas (MS) mostrou que nas cepas de tipo salvaxe, o 95 % da ceramida total é ceramida de cadea moi longa (C26), mentres que en GhLag1, o 85 % da ceramida é moi longa (C18 e C16), só o 2 % da ceramida é ceramida de cadea moi longa (C26). Aínda que as ceramidas C18 e C16 son as principais ceramidas detectadas na membrana de GhLag1 ata o de agora, a análise de MS tamén confirmou que a áncora GPI de Gas1-GFP expresada na cepa GhLag1 contén ceramida C26, que é comparable aos lípidos de tipo salvaxe. A calidade é a mesma (Fig. 3A) (26). Polo tanto, isto significa que o encima remodelador de ceramida Cwh43 é altamente selectivo para a ceramida C26, como se mostra na Figura 26, incorpora preferentemente a áncora GPI dunha pequena cantidade de ceramida C26 na cepa GhLag1. S2 (29). Non obstante, a membrana celular de GhLag1 basicamente só contén ceramida C18-C16, mentres que Gas1-GFP aínda ten ceramida C26. Este feito fai desta cepa unha ferramenta ideal para resolver especificamente o problema da lonxitude da cadea acilo da ceramida de membrana no RE. O papel hipotético da clase e a clasificación. Despois, primeiro estudamos a capacidade de C26 Gas1-GFP para acumularse en clústeres en GhLag1 cun alelo mutante sensible á temperatura de sec31-1 mediante microscopía de fluorescencia convencional, onde só existe a cadea longa (C18-C16) na membrana do RE (Fig. 3). Observamos que en sec31-1, a maior parte de Gas1-GFP estaba concentrada en clústeres, mentres que Gas1-GFP en sec31-1 GhLag1 con ceramida longa (C18-C16) na membrana do RE non estaba principalmente agrupada e distribuída en toda a membrana do RE. Para ser precisos, debido a que a agrupación baseada en ceramida C26 está estreitamente relacionada con ERES específicos (Figura 1), a continuación investigamos se este proceso tamén pode implicar a función do mecanismo da proteína de exportación do RE. GPI-AP usa un sistema COPII especial para a exportación do RE, que está regulado activamente pola remodelación estrutural de Ted1 da porción glicana da áncora GPI (30, 31). O GPI-glicano recombinante é entón recoñecido polo complexo receptor de carga transmembrana p24, que á súa vez recruta selectivamente Lst1, que é unha isoforma específica da principal subunidade de unión á carga de COPII Sec24, formando unha COPII rica en GPI-AP. Son necesarias vesículas (31-33). Polo tanto, construímos un dobre mutante que combinaba a deleción destas proteínas individuais (o compoñente do complexo p24 Emp24, o encima remodelador de GPI-glicano Ted1 e a subunidade específica de COPII Lst1) coa cepa mutante sec31-1 e estudiámolas. É posible formar GFP de clúster Gas1 (Figura 3)? Observamos que en sec31-1emp24Δ e sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP está principalmente sen clústeres e distribuída por toda a membrana do RE, como se viu anteriormente en sec31-1 GhLag1, mentres que en sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP é como sec31-1. Estes resultados indican que, ademais da presenza de ceramida C26 na membrana do RE, a agrupación de Gas1-GFP tamén necesita unirse ao complexo p24 e non require un recrutamento específico de Lst1. Despois, exploramos a posibilidade de que a lonxitude da cadea de ceramida na membrana do RE poida regular a unión de Gas1-GFP a p24. Non obstante, descubrimos que a presenza de ceramida C18-C16 na membrana non afecta os GPI-glicanos reconstruídos polo complexo p24 (Figuras S3 e S4, A e B) nin a unión a GPI-AP e a exportación de GPI-AP. capacidade de recrutar o subtipo Lst1 de COPII (Figura S4C). Polo tanto, a agrupación dependente de ceramida C26 non require interaccións de proteínas con diferentes mecanismos de exportación de proteínas do RE, pero admite un mecanismo de clasificación alternativo impulsado pola lonxitude dos lípidos. Despois, analizamos se a lonxitude da cadea acílica de ceramida na membrana do RE é importante para a clasificación efectiva de Gas1-GFP como ERES selectivo. Dado que o Gas1 na cepa GhLag1 con ceramida de cadea curta sae do RE e entra na membrana plasmática (Figura S5), cremos que se a clasificación está impulsada pola lonxitude da cadea acílica da ceramida, o Gas1 na cepa GhLag1 pode ser redirixido e cruzado. Bens ERES coa mesma membrana.
(A) A membrana celular de GhLag1 contén principalmente ceramidas C18-C16 máis curtas, mentres que a áncora GPI de Gas1-GFP aínda ten o mesmo IPC C26 que as células de tipo salvaxe. Arriba: análise da lonxitude da cadea acilo da ceramida na membrana celular das cepas de tipo salvaxe (Wt) e GhLag1p por espectrometría de masas (MS). Os datos representan a porcentaxe de ceramida total. A media de tres experimentos independentes. Barra de erro = DE. Proba t non pareada de dúas colas. **** P <0,0001. Panel inferior: análise MS da lonxitude da cadea acilo do IPC presente na áncora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) expresada nas cepas de tipo salvaxe e GhLag1p. Os datos representan a porcentaxe do sinal IPC total. Media de cinco experimentos independentes. Barra de erro = DE. Proba t non pareada de dúas colas. ns, non importante. P = 0,9134. (B) Micrografías de fluorescencia de células sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ e sec31-1lst1Δ que expresan Gas1-GFP inducido por galactosa incubáronse a 37 °C durante 30 minutos e pasáronse a realizar unha microscopía de fluorescencia de rutina despois de 24 °C. Frecha branca: grupo de Gas1-GFP do RE. Frecha aberta: a Gas1-GFP non agrupada distribúese por toda a membrana do RE, mostrando a tinción do anel nuclear característica do RE. Barra de escala, 5 μm. (C) Cuantificación da microfotografía descrita en (B). A porcentaxe media de células con estrutura punteada de Gas1-GFP. En tres experimentos independentes, n ≥ 300 células. Barra de erro = DE. Proba t non pareada de dúas colas. **** P <0,0001.
Para resolver directamente este problema, realizamos unha visualización SCLIM de Gas1-GFP e Mid2-iRFP en GhLag1 co alelo mutante sensible á temperatura sec31-1 (Figura 4 e Vídeo S4). Despois de que o RE se retivese a 37 °C e se liberase posteriormente a 24 °C, a maior parte da Gas1-GFP recentemente sintetizada non se agrupou nin se distribuíu por toda a membrana do RE, como se observou cos microscopios convencionais (Figura 4, A e B). Ademais, unha gran porcentaxe de ERES (67 %) inclúe dous tipos de carga colocalizada nela (Figura 4D). Os paneis 1 e 2 da Figura 4C mostran dous exemplos típicos de ERES con Gas1-GFP e Mid2-GFP superpostos. Ademais, ambos os bens foron recrutados no mesmo ERES (Figura 4E, panel 3 e vídeo S4). Polo tanto, os nosos resultados indican que a lonxitude da cadea acílica de ceramida na membrana do RE é un determinante importante da agregación e clasificación de proteínas do RE.
Células Sec31-1 GhLag1 que expresan secrecións inducidas por galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, azul) e Sec13-mCherry marcado con ERES constitutivo (ERES, maxenta). Incubar a 37 °C. Continuar durante 30 minutos, baixar a temperatura a 24 °C para liberar as secrecións e obter imaxes con SCLIM despois de 20 minutos. (A a C) Imaxes de proxección 2D representativas (A; barra de escala, 1 μm) ou imaxes de hemisferios celulares 3D (B e C; unidade de escala, 0,45 μm) das 10 seccións z marcadas por carga e ERES. O panel inferior en (B) e o panel en (C) mostran imaxes procesadas para mostrar só os bens presentes en ERES (maxenta) [Gas1-GFP (gris) e Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Frecha branca chea: ERES, os bens solapanse. Frecha aberta: o ERES contén só un elemento. Panel inferior: o ERES seleccionado ten mercadorías superpostas (1 e 2) marcadas en (C). Barra de escala, 100 nm. (D) Cuantificación da microfotografía descrita en (C). Nas unidades sec31-1 e sec31-1 GhLag1, só se inclúe unha carga (Gas1-GFP ou Mid2-iRFP) e a porcentaxe media de ERES para a carga illada e a carga superposta. En tres experimentos independentes, n = 432 en 54 celas (sec31-1) e n = 430 en 47 celas (sec31-1 GhLag1). Barra de erro = SD. Proba t non pareada de dúas colas. *** P = 0,0002 (sec31-1) e ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imaxe 3D do ERES seleccionado con carga superposta (3) marcada en (C). Gas1-GFP (verde) e Mid2-iRFP (azul) achéganse a ERES (maxenta) polo mesmo lado e permanecen na mesma área restrinxida de ERES. Barra de escala, 100 nm.
Este estudo proporciona evidencia directa in vivo de que as cargas de proteínas baseadas en lípidos se clasifican en sitios de exportación selectivos na vía secretora e revela a importancia da lonxitude da cadea acilo para a selectividade de clasificación. Usando unha técnica de microscopía potente e de vangarda chamada SCLIM, demostramos a Gas1-GFP recentemente sintetizada (unha importante GPI-AP da membrana plasmática cunha porción lipídica de ceramida de cadea acilo (C26) moi longa) en lévedos). As rexións agrupadas en RE discretos están asociadas con ERES específicos, mentres que as proteínas secretadas transmembrana distribúense por toda a membrana do RE (Figura 1). Ademais, estes dous tipos de produtos entran selectivamente en diferentes ERES (Figura 2). A lonxitude da cadea acilo da ceramida celular na membrana redúcese de C26 a C18-C16, o grupo Gas1-GFP distórpese cara á rexión discreta do RE e a Gas1-GFP rediríxese para saír do RE coa proteína transmembrana a través do mesmo ERES (Figura 3 e Figura 3). 4).
Aínda que a GPI-AP emprega un mecanismo proteico especializado para saír do RE, descubrimos que a separación dependente da ceramida C26 non se basea en interaccións diferenciais de proteínas que poidan levar á especialización do ERES (Figuras S4 e S5). En cambio, os nosos achados apoian un mecanismo de clasificación alternativo impulsado pola agrupación de proteínas baseada en lípidos e a posterior exclusión doutras cargas. As nosas observacións indican que a rexión ou clúster Gas1-GFP asociado a un ERES específico carece da proteína segregada transmembrana Mid2-iRFP, o que indica que o clúster GPI-AP dependente da ceramida C26 facilitará a súa entrada no ERES relevante e, ao mesmo tempo, excluirá as secrecións transmembrana. As secrecións entran neste ERES en particular (Figuras 1 e 2). En contraste, a presenza de ceramidas C18-C16 na membrana do RE non fai que a GPI-AP forme rexións ou clústeres, polo que non exclúen nin substitúen as proteínas segregadas transmembrana no mesmo ERES (Figuras 3 e 4). Polo tanto, propoñemos que a ceramida C26 impulsa a separación e a clasificación ao facilitar a agrupación de proteínas ligadas a ERES específicos.
Como conseguir esta agrupación dependente da ceramida C26 nunha área específica do RE? A tendencia da ceramida da membrana a separarse lateralmente pode causar que a GPI-AP e a ceramida C26 formen lípidos pequenos e ordenados instantaneamente no ambiente lipídico máis irregular da membrana do RE que contén glicerolípidos máis curtos e insaturados. Clústeres de calidade (17, 18). Estes pequenos clústeres temporais poden fusionarse aínda máis en clústeres máis grandes e estables despois de unirse ao complexo p24 (34). En consonancia con isto, demostramos que a Gas1-GFP C26 necesita interactuar co complexo p24 para formar clústeres visibles máis grandes (Figura 3). O complexo p24 é un oligómero heterocigoto composto por catro proteínas transmembrana p24 diferentes no lévedo (35), que proporciona unha unión multivalente, que pode levar á reticulación de pequenos clústeres de GPI-AP, xerando así un clúster estable máis grande (34). A interacción entre os ectodominios proteicos das GPI-AP tamén pode contribuír á súa agregación, como se demostra durante o seu transporte no aparato de Golgi en células epiteliais polarizadas de mamíferos (36). Non obstante, cando a ceramida C18-C16 está presente na membrana do retículo endoplasmático (RE), cando o complexo p24 se une a Gas1-GFP, non se forman grandes clústeres separados. O mecanismo subxacente pode depender das propiedades físicas e químicas específicas da ceramida de cadea acilo longa. Os estudos biofísicos de membranas artificiais mostran que, aínda que tanto as ceramidas de cadea acilo longa (C24) como as curtas (C18-C16) poden causar a separación de fases, só as ceramidas de cadea acilo longa (C24) poden promover unha alta curvatura e flexión da película para remodelar a película. A través da referencia mutua (17, 37, 38). Demostrouse que a hélice transmembrana de TMED2, o homólogo humano de Emp24, interactúa selectivamente coa esfingomielina baseada na ceramida C18 nos lóbulos citoplasmáticos (39). Usando simulacións de dinámica molecular (MD), descubrimos que tanto as ceramidas C18 como as C26 se acumulan arredor dos lóbulos citoplasmáticos da hélice transmembrana de Emp24 e teñen preferencias similares (Figura S6). Cómpre sinalar que isto indica que a hélice transmembrana de Emp24 pode levar a unha distribución asimétrica de lípidos na membrana. Este é un resultado recente baseado en células de mamíferos. Simulacións de MD similares tamén mostran a presenza de lípidos éter (40). Polo tanto, especulamos que a ceramida C26 nos dous lóbulos de ER26 está enriquecida localmente. Cando a GPI-AP nos lóbulos luminais se une directamente á p24 multivalente e á acumulación de ceramida C26 arredor da p24 nos lóbulos citoplasmáticos, pode promover a agregación de proteínas e a curvatura da membrana que a acompañan, que se xeran a través dos dedos (41), o que fai que a GPI-AP se separe en rexións discretas adxacentes ao ERES, o que tamén favorece as rexións moi curvadas da membrana do RE (42). Informes previos apoiaron o mecanismo proposto (43, 44). A unión multivalente de oligolectinas, patóxenos ou anticorpos a glicoesfingolípidos (GSL) baseados en ceramidas na membrana plasmática desencadea unha gran agregación de GSL, mellora a separación de fases e causa a deformación e internalización da membrana (44). Iwabuchi etc. (43) Descubriuse que en presenza de cadeas acilo longas (C24) pero non curtas (C16), o ligando multivalente unido á lactosilceramida GSL inducía a formación de grandes clústeres e invaxinación da membrana, e a transdución de sinais mediada por Lyn no citoplasma nas valvas está interdixitada por cadeas acilo en neutrófilos acoplados.
Nas células epiteliais polarizadas dos mamíferos, a concentración da rede anti-Golgi (TGN) ao nivel da membrana plasmática apical controla a separación e clasificación de GPI-AP (10, 45). Esta agregación está impulsada pola oligomerización de GPI-AP (36), pero tamén pode depender da lonxitude da cadea de ceramida que atopamos no lévedo. Aínda que a GPI-AP dos mamíferos ten unha áncora lipídica éter e a súa estrutura química é moi diferente da ceramida de cadea acilo moi longa, un estudo recente descubriu que ambos lípidos teñen propiedades físicas e químicas e función evolutivamente similares (40). Polo tanto, a parte lipídica éter nas células dos mamíferos pode ser similar á ceramida C26 no lévedo e o seu papel é asociarse coa ceramida de cadea longa na membrana para promover a agregación e clasificación de GPI-AP. Aínda que esta posibilidade aínda debe ser probada directamente, achados previos apoian que o transporte da ceramida de cadea acilo longa ao corpo de Golgi non se leva a cabo mediante proteínas de transferencia citoplasmática, senón que depende da síntese de áncoras GPI como o lévedo. Polo tanto, o mecanismo conservador evolutivo semella ser capaz de cotransportar selectivamente ceramida de cadea acílica moi longa e GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) na mesma vesícula de transporte.
Nos sistemas de células epiteliais polarizadas de lévedos e mamíferos, a agregación e separación de GPI-AP doutras proteínas da membrana plasmática ocorren antes de alcanzar a superficie celular. Paladino et al. (48) descubriron que no TGN das células epiteliais polarizadas de mamíferos, a agrupación de GPI-AP non só é necesaria para a clasificación selectiva das GPI-AP na membrana plasmática apical, senón que tamén regula a organización en agrupación das GPI-AP e a súa actividade biolóxica. Superficie celular. Nos lévedos, este estudo mostrou que a agrupación de GPI-AP dependente da ceramida C26 no RE pode regular a organización en agrupación e a actividade funcional da GPI-AP na membrana plasmática (24, 49). De acordo con este modelo, as células GhLag1 son alérxicas aos inhibidores de GPI ou aos fármacos que afectan a integridade da parede celular (28), e a necesidade de agrupacións funcionais de Gas1-GFP (49) da ceramida da punta proxectada no apareamento das células de lévedo indica posibles consecuencias fisiolóxicas das células hLag1. Erro de GPI-AP. Non obstante, o obxecto da nosa investigación futura será comprobar máis a fondo se a organización funcional da superficie celular foi programada desde o RE mediante un método de clasificación baseado na lonxitude dos lípidos.
As cepas de Saccharomyces cerevisiae empregadas neste traballo aparecen listadas na Táboa S1. As cepas MMY1583 e MMY1635 de SCLIM para a obtención de imaxes de células vivas construíronse no contexto da W303. Estas cepas que expresan Sec13-mCherry cunha etiqueta de proteína fluorescente construíronse empregando un método baseado na reacción en cadea da polimerase (PCR) co plásmido pFA6a como modelo (23). A cepa que expresa Mid2-iRFP marcada con proteína fluorescente baixo o control do promotor GAL1 construíuse do seguinte xeito. Amplificación por PCR da secuencia iRFP-KanMx a partir do vector pKTiRFP-KAN (agasallo de E. O'Shea, plásmido Addgene número 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificador de recursos de investigación (RRID): Addgene_64687) e inserida no extremo C-terminal do Mid2 endóxeno. Despois de amplificar e clonar a secuencia xenómica de Mid2-iRFP no promotor GAL1, integrouse no sitio Not I-Sac I do plásmido de integración pRS306. O plásmido resultante pRGS7 linealizouse con Pst I para integrarse no locus URA3.
O xene de fusión Gas1-GFP exprésase baixo o control do promotor GAL1 no plásmido do centrómero (CEN), que se constrúe do seguinte xeito. A secuencia Gas1-GFP amplificouse por PCR a partir do plásmido pRS416-GAS1-GFP (24) (agasallo de L. Popolo) e clonouse no sitio Xma I–Xho I do plásmido CEN pBEVY-GL LEU2 (agasallo de C). Miller; número de plásmido Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). O plásmido resultante denominouse pRGS6. O xene de fusión Axl2-GFP tamén se expresa baixo o control do promotor GAL1 do vector pBEVY-GL LEU2, e a súa construción é a seguinte. A secuencia Axl2-GFP amplificouse a partir do plásmido pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) mediante PCR e clonouse no sitio Bam HI-Pst I do vector pBEVY-GL LEU2. O plásmido resultante denominouse pRGS12. A secuencia dos oligonucleótidos empregados neste estudo aparece na Táboa S2.
A cepa suplementouse cun 0,2 % de adenina e un 2 % de glicosa [YP-dextrosa (YPD)], un 2 % de rafinosa [YP-rafinosa], un medio de proteína de extracto de lévedo rico en p (YP) (1 % de extracto de lévedo e 2 % de proteína ept). (YPR)] ou un 2 % de galactosa [YP-galactosa (YPG)] como fonte de carbono, ou nun medio mínimo sintético (0,15 % de base nitroxenada de lévedo e 0,5 % de sulfato de amonio) para suplementar os aminoácidos e bases axeitados necesarios para a nutrición, e que contiña un 2 % de glicosa (medio mínimo de glicosa sintética) ou un 2 % de galactosa (medio mínimo de galactosa sintética) como fonte de carbono.
Para a obtención de imaxes en tempo real, as células mutantes sec31-1 sensibles á temperatura que expresan a construción baixo o promotor GAL1 cultiváronse en medio YPR a 24 °C durante a noite ata a fase logarítmica media. Despois da indución en YPG a 24 °C durante 1 hora, as células incubáronse en SG a 37 °C durante 30 minutos e despois transferíronse a 24 °C para liberalas do bloque de secreción. Utilizouse concanavalina A para fixar as células nun portaobxectos de vidro e obtivéronse imaxes mediante SCLIM. SCLIM é unha combinación do microscopio de fluorescencia invertida Olympus IX-71 e unha lente de aceite de apertura numérica UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), un escáner confocal de disco rotatorio de alta velocidade e alta relación sinal-ruído (Yokogawa Electric), un espectrómetro personalizado e un sistema de refrixeración personalizado. O intensificador de imaxe do sistema (Hamamatsu Photonics) pode proporcionar un sistema de lentes de aumento cun aumento final de ×266.7 e unha cámara de dispositivo de carga acoplada que multiplica electróns (Hamamatsu Photonics) (21). A adquisición de imaxes realízase mediante software personalizado (Yokogawa Electric). Para as imaxes en 3D, empregamos un actuador piezoeléctrico feito á medida para facer vibrar a lente obxectiva verticalmente e recollemos as partes ópticas separadas por 100 nm nunha pila. A imaxe da pila Z convértese en datos de vóxel en 3D e a función de dispersión de puntos teórica utilizada para o microscopio confocal de disco rotatorio utilízase para o procesamento de deconvolución mediante o software Volocity (PerkinElmer). Mediante o software Volocity para establecer automaticamente o limiar para a análise de colocalización, mediuse o ERES, incluída a carga. A análise de exploración lineal realizouse mediante o software MetaMorph (Molecular Devices).
Empregar o software GraphPad Prism para determinar a significación estatística. Para a proba t de Student bilateral e a proba de análise da varianza unidireccional ordinaria (ANOVA), considérase que as diferenzas entre os grupos teñen un impacto significativo en P < 0,05 (*).
Para a microscopía de fluorescencia de Gas1-GFP, as células en fase logarítmica cultiváronse durante a noite en YPD e recolléronse por centrifugación, laváronse dúas veces con solución salina tamponada con fosfato e incubáronse en xeo durante polo menos 15 minutos, e despois procedéronse ao microscopio como se describiu anteriormente no punto de comprobación (24). Para a adquisición utilizouse o microscopio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) equipado cunha lente obxectiva, un filtro L5 (GFP), unha cámara Hamamatsu e o software Application Suite X (LAS X).
As mostras desnaturalizáronse con tampón de mostra SDS a 65 °C durante 10 minutos e, a continuación, separáronse mediante electroforese en xel de poliacrilamida-SDS (PAGE). Para a análise de inmunotransferencia, cargouse 10 μl de mostra por carril. Anticorpo primario: uso de anti-Gas1 policlonal de coello a unha dilución de 1:3000, anti-Emp24 policlonal de coello a unha dilución de 1:500 e anti-GFP policlonal de coello (agasallo de H. Riezman) a unha dilución de 1:3000. O anticorpo monoclonal de rato anti-Pgk1 usouse a unha dilución de 1:5000 (agasallo de J. de la Cruz). Anticorpo secundario: inmunoglobulina G de cabra anti-coello (IgG) conxugada con peroxidase de ravo picante (HRP) usada a unha dilución de 1:3000 (Pierce). Empregouse IgG de cabra anti-rato conxugada con HRP a unha dilución de 1:3000 (Pierce). A zona de resposta inmunitaria observouse mediante o método de quimioluminiscencia do reactivo SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Como se describe en (31), realizouse un experimento de inmunoprecipitación natural na fracción de RE enriquecida. En resumo, laváronse as células de lévedo con tampón TNE [50 mM de tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo e unha mestura de inhibidores da protease) a 600 nm (DO600) a unha densidade óptica de 100 dúas veces. Rompeuse con esferas de vidro e, a continuación, elimináronse os restos celulares e as esferas de vidro mediante centrifugación. O sobrenadante centrifugouse entón a 17.000 g durante 15 minutos a 4 °C. O precipitado resuspendiuse en TNE e engadiuse saponina dixital a unha concentración final do 1 %. A suspensión incubouse durante 1 hora con rotación a 4 °C e, a continuación, os compoñentes insolubles elimináronse mediante centrifugación a 13.000 g a 4 °C durante 60 minutos. Para a inmunoprecipitación con Gas1-GFP, primeiro preincube a mostra con esferas de agarosa baleiras (ChromoTek) a 4 °C durante 1 hora e, a continuación, incube con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durante 3 horas. As esferas inmunoprecipitadas laváronse cinco veces con TNE que contiña digoxixenina ao 0,2 %, eluíronse con tampón de mostra SDS, separáronse en SDS-PAGE e analizáronse mediante inmunotransferencia.
Como se describe en (31), a determinación da reticulación realizouse na fracción de ER enriquecida. En resumo, a fracción de ER enriquecida incubouse con 0,5 mM de ditiobis(propionato de succinimidilo) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA; 20 °C, 20 min). A reacción de reticulación inactivouse engadindo glicina (concentración final de 50 mM, 5 minutos, 20 °C).
Como se describiu previamente (50), realizouse unha análise de MS de ceramida en cepas de tipo salvaxe e GhLag1. En resumo, as células cultiváronse ata a fase exponencial (de 3 a 4 unidades OD600/ml) en YPD a 30 °C e recolléronse 25 × 107 células. O seu metabolismo inactivouse con ácido tricloroacético. Utilícese o solvente de extracción [etanol, auga, éter, piridina e hidróxido de amonio 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol de estándar interno de ceramida C17 (860517, lípido polar Avanti)). Utilícese o reactivo de monometilamina [metanol, auga, n-butanol e solución de metilamina (4:3:1:5 v/v)] para realizar unha hidrólise alcalina suave do extracto e, a continuación, use n-butanol saturado en auga para desalar. Finalmente, o extracto resuspendiuse nun solvente de modo positivo [cloroformo/metanol/auga (2:7:1) + 5 mM de acetato de amonio] e inxectouse no espectrómetro de masas. Realizouse unha monitorización multirreacción (MRM) para a identificación e cuantificación de moléculas de esfingolípidos. O espectrómetro de masas cuadrupolar terciario TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) está equipado cunha fonte de ións de nanofluxo robótica Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para a análise de lípidos. A enerxía de colisión está optimizada para cada categoría de ceramida. Os datos de MS obtivéronse en modo positivo. Para cada réplica biolóxica, o sinal lipídico é a mediana de tres medicións independentes.
Como se describe en (31), as células (800×107) que expresaban Gas1-GFP foron sometidas a inmunoprecipitación natural. O Gas1-GFP purificado separouse mediante SDS-PAGE e transferiuse a unha membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). A proteína visualizouse tinguindo PVDF con negro de amida. A banda de Gas1-GFP cortouse do PVDF e lavouse 5 veces con metanol e unha vez con auga de grao cromatografía líquida-MS (LC-MS). Ao incubar a tira de membrana con 500 μl de NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampón e 500 μl de mestura de nitrito de sodio 1 M recentemente disolta a 37 °C durante 3 horas, a fracción lipídica libérase do Gas1-GFP e lisase a ceramida de fosfato de inosina entre a glucosamina e o inositol (51). Despois diso, a tira de membrana lavouse catro veces con auga de grao LC-MS, secouse a temperatura ambiente e almacenouse nunha atmosfera de nitróxeno a -80 °C ata a súa análise. Como control, utilizouse unha mostra en branco de membrana de PVDF para cada experimento. O lípido extraído de Gas1-GFP analizouse mediante MS como se describe (50). En resumo, as tiras de PVDF que contiñan lípido GPI resuspendironse en 75 μl de disolvente de molde negativo [cloroformo/metanol (1:2) + 5 mM de acetato de amonio] e pasaron por análise de especies de esfingolípidos por ionización por electropulverización (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). Neste caso, os datos de MS obtivéronse en modo de ións negativos.
Como se mencionou anteriormente, a porción lipídica da áncora GPI separouse do GPI-AP marcado con [3H]-inositol (16). Os lípidos separáronse mediante cromatografía en capa fina empregando un sistema de solventes (55:45:10 cloroformo-metanol-0,25 % KCl) e visualizáronse empregando FLA-7000 (Fujifilm).
As células que expresaban Gas1-GFP (600×107) laváronse dúas veces con tampón TNE con tampón TNE e romperonse con esferas de vidro, e logo centrifugáronse para eliminar os restos celulares e as esferas de vidro. O sobrenadante centrifugouse entón a 17.000 g durante 1 hora a 4 °C. O precipitado lavouse en TNE e incubouse con 1 U de PI-PLC (Invitrogen) en TNE que contiña 0,2 % de saponina dixital durante 1 hora a 37 °C. Despois do tratamento encimático, a membrana retirouse por centrifugación a 17.000 g a 4 °C durante 1 hora. Para inmunoprecipitar Gas1-GFP, o sobrenadante incubouse con GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durante a noite. O Gas1-GFP purificado separado por SDS-PAGE tinguíuse con azul brillante de Coomassie. A banda de tinguidura Gas1-GFP cortouse do gris que rodeaba o acueduto e, despois da alquilación con iodoacetamida e a redución con ditiotreitol, realizouse unha dixestión en xel con tripsina. Extraéronse e secan os péptidos trípticos e os péptidos con GPI-glicanos. O péptido seco disolveuse en 20 μl de auga. Inxectase unha porción (8 μl) no LC. Utilizouse unha columna de octadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diámetro interior 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefectura de Aichi, Xapón) para separar os péptidos en condicións de gradiente específicas. A fase móbil é o solvente A (0,08 % de ácido fórmico) e o solvente B (0,15 % de ácido fórmico en 80 % de acetonitrilo). Empregouse un sistema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) para eluír a columna co solvente A en 55 minutos a un caudal de 50 μl min-1 durante 5 minutos, e despois a concentración do solvente B aumentouse ao 40 %. (Estados Unidos). O eluato introduciuse continuamente na fonte de ións ESI e os péptidos trípticos e os péptidos con GPI-glicanos analizáronse mediante LTQ Orbitrap XL (espectrómetro de masas híbrido lineal de trampa de ións-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Na configuración MS, a voltaxe da fonte capilar axustouse a 4,5 kV e a temperatura do capilar de transferencia mantívose a 300 °C. A voltaxe capilar e a voltaxe da lente do tubo axustáronse a 15 V e 50 V, respectivamente. Os datos de MS obtivéronse no modo de ións positivos (resolución de 60.000; precisión de masa de 10 partes por millón) nun rango de masa de 300/m/z e unha relación masa/carga (m/z) de 3000. Os datos de MS/MS obtívense a través da trampa de ións do LTQ Orbitrap XL [os 3 primeiros díxitos dos que dependen os datos, disociación inducida por colisión (CID)].
As simulacións de MD realizáronse empregando o software GROMACS (52) e o campo de forza MARTINI 2 (53-55). A continuación, utilizouse o Construtor de Membranas da GUI CHARMM (56, 57) para construír unha bicapa que contiña dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e Cer C18 ou DOPC e Cer C26. A topoloxía e as coordenadas de Cer C26 derívanse de DXCE eliminando as esferas adicionais da cola de esfingosina. Utilícese o proceso descrito a continuación para equilibrar a dobre capa e executala, e despois use as últimas coordenadas do sistema para construír un sistema que conteña Emp24. O dominio transmembrana do lévedo Emp24 (residuos 173 a 193) construíuse como unha α-hélice empregando a estrutura molecular da ferramenta visual MD (VMD) (58). Despois, tras eliminar os lípidos superpostos, a proteína granulouse groseiramente e inseriuse na bicapa empregando a GUI CHARMM. O sistema final contén 1202 DOPC e 302 Cer C26 ou 1197 DOPC e 295 Cer C18 e Emp24. Ionizar o sistema a unha concentración de 0,150 M. Realizáronse catro réplicas independentes para dúas composicións de bicapa.
A bicapa lipídica é equilibrada mediante o proceso CHARMM GUI, que implica minimizar e despois equilibrar 405.000 pasos, onde as restricións de posición se reducen e eliminan gradualmente, e o paso de tempo aumenta de 0,005 ps a 0,02 ps. Despois do equilibrado, produce 6 µs cun paso de tempo de 0,02 ps. Despois de inserir Emp24, use o mesmo proceso CHARMM GUI para minimizar e equilibrar o sistema e, a continuación, execúteo durante 8 s en produción.
Para todos os sistemas, durante o proceso de equilibrio, a presión contrólase mediante o barostato Berendsen (59) e, durante o proceso de produción, a presión contrólase mediante o barostato Parrinello-Rahman (60). En todos os casos, a presión media é de 1 bar e utilízase un esquema de acoplamento de presión semiisotrópico. No proceso de equilibrio e produción, utilízase un termostato (61) con recalibración de velocidade para acoplar a temperatura das partículas de proteínas, lípidos e solventes, respectivamente. Durante toda a operación, a temperatura obxectivo é de 310 K. A interacción sen enlace calcúlase xerando unha lista de emparellamentos usando o esquema de Verlet cunha tolerancia de tampón de 0,005. O termo de Coulomb calcúlase usando o campo de reacción e unha distancia de corte de 1,1 nm. O termo de Vander Waals usa un esquema de corte cunha distancia de corte de 1,1 nm e o esquema de corte de Verlet utilízase para a deriva potencial (62).
Usando VMD, a lonxitude de onda de corte entre as esferas de fosfato DOPC ou as esferas de ceramida AM1 e a proteína é de 0,7 nm, e calcúlase o número de lípidos que interactúan coa proteína. Segundo a seguinte fórmula, calcule o factor de enriquecemento por esgotamento (DE) como en (63): Factor DE = (a cantidade de lípidos totais na proteína 0,7) na proteína 0,7 (a cantidade de Cer nos lípidos totais)
O valor informado obtense como media e as barras de erro son catro copias independentes da SE. A significación estatística do factor DE calcúlase mediante a proba t [(factor DE medio-1)/SE]. Calcule o valor P a partir da distribución unilateral.
A ferramenta GROMACS empregouse para calcular o mapa de densidade lateral 2D do sistema que contén Emp24 nos últimos 250 ns do trazo. Para obter o mapa de enriquecemento/esgotamento da ceramida, o mapa de densidade de Cer divídese pola suma do mapa de Cer e DOPC e, a continuación, divídese pola concentración de Cer no corpo. Úsase a mesma escala de mapa de cores.
Para obter materiais complementarios para este artigo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Este é un artigo de acceso aberto distribuído baixo os termos da licenza Creative Commons Atribución-NonComercial, que permite o uso, a distribución e a reprodución en calquera medio, sempre que o uso final non sexa para beneficio comercial e a premisa sexa que a obra orixinal sexa correcta. Referencia.
Nota: Só che pedimos que facilites o teu enderezo de correo electrónico para que a persoa que recomendas á páxina saiba que queres que vexa o correo electrónico e que non é spam. Non capturaremos ningún enderezo de correo electrónico.
Esta pregunta úsase para comprobar se es visitante e evitar o envío automático de correo lixo.
Sofia Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gómez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana María Pérez -Linero), Sergio López (Sergio López), Ar Miho Waga (Misko López), Ar Miho Waga (Misko) Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
As imaxes 3D de alta resolución en tempo real revelan a importancia da lonxitude da cadea de ceramida para a clasificación de proteínas en sitios de saída selectivos.
Sofia Rodríguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gómez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana María Pérez -Linero), Sergio López (Sergio López), Ar Miho Waga (Misko López), Ar Miho Waga (Misko) Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
As imaxes 3D de alta resolución en tempo real revelan a importancia da lonxitude da cadea de ceramida para a clasificación de proteínas en sitios de saída selectivos.
©2020 Asociación Americana para o Avance da Ciencia. todos os dereitos reservados. AAAS é socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.