Grazas por visitar nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses a versión máis recente do navegador (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a compatibilidade continua, este sitio non incluirá estilos nin JavaScript.
O sulfuro de hidróxeno (H2S) ten múltiples efectos fisiolóxicos e patolóxicos no corpo humano. O hidrosulfuro de sodio (NaHS) úsase amplamente como ferramenta farmacolóxica para avaliar os efectos do H2S en experimentos biolóxicos. Aínda que a perda de H2S das solucións de NaHS só leva uns minutos, as solucións de NaHS empregáronse como compostos doantes para o H2S na auga potable nalgúns estudos con animais. Este estudo investigou se a auga potable cunha concentración de NaHS de 30 μM preparada en botellas de rata/rato podía permanecer estable durante polo menos 12-24 horas, como suxiren algúns autores. Prepare unha solución de NaHS (30 μM) en auga potable e vértaa inmediatamente en botellas de auga de rata/rato. Recolléronse mostras da punta e do interior da botella de auga ás 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e 24 horas para medir o contido de sulfuro usando o método do azul de metileno. Ademais, inxectóuselles NaHS (30 μM) a ratas macho e femia durante dúas semanas e as concentracións de sulfuro sérico medíronse cada dous días durante a primeira semana e ao final da segunda semana. A solución de NaHS na mostra obtida da punta da botella de auga era inestable; diminuíu un 72 % e un 75 % despois de 12 e 24 horas, respectivamente. Nas mostras obtidas do interior das botellas de auga, a diminución de NaHS non foi significativa ás 2 horas; non obstante, diminuíu un 47 % e un 72 % despois de 12 e 24 horas, respectivamente. A inxección de NaHS non afectou o nivel de sulfuro sérico das ratas macho e femia. En conclusión, as solucións de NaHS preparadas a partir de auga potable non se deben usar para a doazón de H2S porque a solución é inestable. Esta vía de administración expoñerá os animais a cantidades irregulares e menores do esperado de NaHS.
O sulfuro de hidróxeno (H2S) utilízase como toxina desde o ano 1700; non obstante, o seu posible papel como molécula de biosinalización endóxena foi descrito por Abe e Kimura en 1996. Durante as últimas tres décadas, dilucidáronse numerosas funcións do H2S en varios sistemas humanos, o que levou á conclusión de que as moléculas doantes de H2S poden ter aplicacións clínicas no tratamento ou xestión de certas enfermidades; véxase Chirino et al. para unha revisión recente.
O hidrosulfuro de sodio (NaHS) utilizouse amplamente como ferramenta farmacolóxica para avaliar os efectos do H2S en moitos estudos con cultivos celulares e animais5,6,7,8. Non obstante, o NaHS non é un doador ideal de H2S porque se converte rapidamente en H2S/HS- en solución, contamínase facilmente con polisulfuros e oxídase e volatilízase con facilidade4,9. En moitos experimentos biolóxicos, o NaHS disólvese en auga, o que resulta nunha volatilización pasiva e perda de H2S10,11,12, oxidación espontánea do H2S11,12,13 e fotólise14. O sulfuro na solución orixinal pérdese moi rapidamente debido á volatilización do H2S11. Nun recipiente aberto, a vida media (t1/2) do H2S é duns 5 minutos e a súa concentración diminúe aproximadamente un 13 % por minuto10. Aínda que a perda de sulfuro de hidróxeno das solucións de NaHS só leva uns minutos, algúns estudos en animais empregaron solucións de NaHS como fonte de sulfuro de hidróxeno na auga potable durante 1–21 semanas, substituíndo a solución que contén NaHS cada 12–24 horas.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Esta práctica non é coherente cos principios da investigación científica, xa que as dosificacións dos fármacos deberían basearse no seu uso noutras especies, especialmente en humanos.27
A investigación preclínica en biomedicina ten como obxectivo mellorar a calidade da atención aos pacientes ou os resultados do tratamento. Non obstante, os resultados da maioría dos estudos en animais aínda non se trasladaron aos humanos28,29,30. Unha das razóns deste fracaso na tradución é a falta de atención á calidade metodolóxica dos estudos en animais30. Polo tanto, o obxectivo deste estudo foi investigar se as solucións de NaHS de 30 μM preparadas en botellas de auga de rata/rato poderían permanecer estables na auga potable durante 12-24 h, como se afirma ou suxire nalgúns estudos.
Todos os experimentos deste estudo realizáronse de acordo coas directrices publicadas para o coidado e o uso de animais de laboratorio en Irán31. Todos os informes experimentais deste estudo tamén seguiron as directrices ARRIVE32. O Comité de Ética do Instituto de Ciencias Endócrinas da Universidade de Ciencias Médicas Shahid Beheshti aprobou todos os procedementos experimentais deste estudo.
O dihidrato de acetato de zinc (CAS: 5970-45-6) e o cloruro férrico anhidro (CAS: 7705-08-0) foron adquiridos a Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francia). O hidrato de hidrosulfuro de sodio (CAS: 207683-19-0) e a N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (CAS: 535-47-0) foron adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O isoflurano foi adquirido a Piramal (Bethlehem, PA, EUA). O ácido clorhídrico (HCl) foi adquirido a Merck (Darmstadt, Alemaña).
Prepare unha solución de NaHS (30 μM) en auga potable e vértaa inmediatamente nas botellas de auga de ratas/ratos. Esta concentración elixiuse en función de numerosas publicacións que empregan NaHS como fonte de H2S; consulte a sección de Discusión. O NaHS é unha molécula hidratada que pode conter cantidades variables de auga de hidratación (é dicir, NaHS•xH2O); segundo o fabricante, a porcentaxe de NaHS empregada no noso estudo foi do 70,7 % (é dicir, NaHS•1,3 H2O) e tivemos en conta este valor nos nosos cálculos, onde empregamos un peso molecular de 56,06 g/mol, que é o peso molecular do NaHS anhidro. A auga de hidratación (tamén chamada auga de cristalización) son as moléculas de auga que compoñen a estrutura cristalina33. Os hidratos teñen propiedades físicas e termodinámicas diferentes en comparación cos anhidratos34.
Antes de engadir NaHS á auga potable, mida o pH e a temperatura do disolvente. Verte inmediatamente a solución de NaHS na botella de auga para ratas/ratos na gaiola dos animais. Recolléronse mostras da punta e do interior da botella de auga ás 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e 24 h para medir o contido de sulfuro. As medicións de sulfuro tomáronse inmediatamente despois de cada mostraxe. Obtivemos mostras da punta do tubo porque algúns estudos demostraron que o pequeno tamaño dos poros do tubo de auga pode minimizar a evaporación de H2S15,19. Este problema parece aplicarse tamén á solución da botella. Non obstante, este non foi o caso da solución no pescozo da botella de auga, que tiña unha maior taxa de evaporación e era autooxidante; de ​​feito, os animais beberon esta auga primeiro.
No estudo empregáronse ratas Wistar machos e femias. As ratas aloxáronse en gaiolas de polipropileno (2–3 ratas por gaiola) en condicións estándar (temperatura 21–26 °C, humidade 32–40 %) con 12 h de luz (de 7:00 a 19:00) e 12 h de escuridade (de 19:00 a 7:00). As ratas tiñan acceso libre á auga da billa e alimentáronse con comida estándar (Khorak Dam Pars Company, Teherán, Irán). As ratas Wistar femias (n=10, peso corporal: 190–230 g) e machos (n=10, peso corporal: 320–370 g) emparelladas por idade (6 meses) dividíronse aleatoriamente en grupos de control e tratados con NaHS (30 μM) (n=5 por grupo). Para determinar o tamaño da mostra, empregamos o enfoque KISS (Keep It Simple, Stupid), que combina experiencia previa e análise de potencia35. Primeiro realizamos un estudo piloto con 3 ratas e determinamos o nivel medio de sulfuro total no soro e a desviación estándar (8,1 ± 0,81 μM). Despois, considerando unha potencia do 80 % e asumindo un nivel de significación bilateral do 5 %, determinamos un tamaño de mostra preliminar (n = 5 segundo a literatura previa) que correspondía a un tamaño de efecto estandarizado de 2,02 co valor predefinido suxerido por Festing para calcular o tamaño da mostra de animais de experimentación35. Despois de multiplicar este valor pola desviación estándar (2,02 × 0,81), o tamaño do efecto detectable previsto (1,6 μM) foi do 20 %, o que é aceptable. Isto significa que n = 5/grupo é suficiente para detectar unha variación media do 20 % entre os grupos. As ratas dividíronse aleatoriamente en grupos de control e tratados con NaSH usando a función aleatoria do software Excel36 (Figura suplementaria 1). O cegamento realizouse a nivel de resultado e os investigadores que realizaron as medicións bioquímicas non coñecían as asignacións de grupos.
Os grupos de NaHS de ambos os sexos foron tratados cunha solución de NaHS a 30 μM preparada en auga potable durante 2 semanas; subministrause unha solución fresca cada 24 horas, tempo durante o cal se mediu o peso corporal. Recolléronse mostras de sangue das puntas das colas de todas as ratas baixo anestesia con isoflurano cada dous días ao final da primeira e segunda semana. As mostras de sangue centrifugáronse a 3000 g durante 10 minutos, o soro separouse e almacenouse a –80 °C para a posterior medición da urea sérica, a creatinina (Cr) e o sulfuro total. A urea sérica determinouse mediante o método enzimático da urease e a creatinina sérica mediante o método fotométrico de Jaffe utilizando kits dispoñibles comercialmente (Man Company, Teherán, Irán) e un analizador automático (Selectra E, número de serie 0-2124, Países Baixos). Os coeficientes de variación intra e interensaio para a urea e o Cr foron inferiores ao 2,5 %.
O método do azul de metileno (MB) úsase para medir o sulfuro total en auga potable e soro que contén NaHS; o MB é o método máis empregado para medir o sulfuro en solucións a granel e mostras biolóxicas11,37. O método MB pódese empregar para estimar a reserva total de sulfuros38 e medir sulfuros inorgánicos en forma de H2S, HS- e S2 na fase acuosa39. Neste método, o xofre precipita como sulfuro de cinc (ZnS) en presenza de acetato de cinc11,38. A precipitación con acetato de cinc é o método máis empregado para separar os sulfuros doutros cromóforos11. O ZnS redisolveuse usando HCl11 en condicións fortemente ácidas. O sulfuro reacciona co DMPD nunha proporción estequiométrica de 1:2 nunha reacción catalizada por cloruro férrico (o Fe3+ actúa como axente oxidante) para formar o colorante MB, que se detecta espectrofotometricamente a 670 nm40,41. O límite de detección do método MB é de aproximadamente 1 μM11.
Neste estudo, engadíronse 100 μL de cada mostra (solución ou soro) a un tubo; despois engadíronse 200 μL de acetato de zinc (1 % p/v en auga destilada), 100 μL de DMPD (20 mM en HCl 7,2 M) e 133 μL de FeCl3 (30 mM en HCl 1,2 M). A mestura incubouse a 37 °C na escuridade durante 30 minutos. A solución centrifugouse a 10.000 g durante 10 minutos e a absorbancia do sobrenadante leuse a 670 nm usando un lector de microplacas (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, EUA). As concentracións de sulfuro determináronse usando unha curva de calibración de NaHS (0–100 μM) en ddH2O (Figura suplementaria 2). Todas as solucións utilizadas para as medicións preparáronse recentemente. Os coeficientes de variación intraensaio e interensaio para as medicións de sulfuro foron do 2,8 % e do 3,4 %, respectivamente. Tamén determinamos o sulfuro total recuperado de mostras de auga potable e soro que conteñen tiosulfato de sodio empregando o método de mostra fortificada42. As recuperacións para mostras de auga potable e soro que conteñen tiosulfato de sodio foron do 91 ± 1,1 % (n = 6) e do 93 ± 2,4 % (n = 6), respectivamente.
A análise estatística realizouse empregando o software GraphPad Prism versión 8.0.2 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA, www.graphpad.com). Empregouse unha proba t pareada para comparar a temperatura e o pH da auga potable antes e despois da adición de NaHS. A perda de H2S na solución que contiña NaHS calculouse como unha porcentaxe de diminución respecto á absorción basal e, para avaliar se a perda era estatisticamente significativa, realizamos unha ANOVA de medidas repetidas unidireccional seguida da proba de comparación múltiple de Dunnett. O peso corporal, a urea sérica, a creatinina sérica e o sulfuro sérico total ao longo do tempo comparáronse entre ratas de control e tratadas con NaHS de diferentes sexos empregando unha ANOVA mixta bidireccional (entre-dentro) seguida dunha proba post hoc de Bonferroni. Os valores de P bilateral < 0,05 consideráronse estatisticamente significativos.
O pH da auga potable era de 7,60 ± 0,01 antes da adición de NaHS e de 7,71 ± 0,03 despois da adición de NaHS (n = 13, p = 0,0029). A temperatura da auga potable era de 26,5 ± 0,2 e diminuíu a 26,2 ± 0,2 despois da adición de NaHS (n = 13, p = 0,0128). Prepare unha solución de NaHS de 30 μM en auga potable e gárdea nunha botella de auga. A solución de NaHS é inestable e a súa concentración diminúe co tempo. Ao tomar mostras do pescozo da botella de auga, observouse unha diminución significativa (68,0 %) na primeira hora, e o contido de NaHS na solución diminuíu un 72 % e un 75 % despois de 12 e 24 horas, respectivamente. Nas mostras obtidas de botellas de auga, a redución de NaHS non foi significativa ata as 2 horas, pero despois de 12 e 24 horas diminuíra un 47 % e un 72 %, respectivamente. Estes datos indican que a porcentaxe de NaHS nunha solución de 30 μM preparada en auga potable diminuíu a aproximadamente unha cuarta parte do valor inicial despois de 24 horas, independentemente da localización da mostraxe (Figura 1).
Estabilidade da solución de NaHS (30 μM) en auga potable en botellas de rata/rato. Despois da preparación da solución, tomáronse mostras da punta e do interior da botella de auga. Os datos preséntanse como media ± desviación estándar (n = 6/grupo). * e #, P < 0,05 en comparación co tempo 0. A fotografía da botella de auga mostra a punta (coa abertura) e o corpo da botella. O volume da punta é de aproximadamente 740 μL.
A concentración de NaHS na solución de 30 μM recentemente preparada foi de 30,3 ± 0,4 μM (rango: 28,7–31,9 μM, n = 12). Non obstante, despois de 24 h, a concentración de NaHS diminuíu a un valor máis baixo (media: 3,0 ± 0,6 μM). Como se mostra na Figura 2, as concentracións de NaHS ás que foron expostas as ratas non foron constantes durante o período de estudo.
O peso corporal das ratas femias aumentou significativamente co tempo (de 205,2 ± 5,2 g a 213,8 ​​± 7,0 g no grupo de control e de 204,0 ± 8,6 g a 211,8 ± 7,5 g no grupo tratado con NaHS); non obstante, o tratamento con NaHS non tivo ningún efecto sobre o peso corporal (Fig. 3). O peso corporal das ratas machos aumentou significativamente co tempo (de 338,6 ± 8,3 g a 352,4 ± 6,0 g no grupo de control e de 352,4 ± 5,9 g a 363,2 ± 4,3 g no grupo tratado con NaHS); non obstante, o tratamento con NaHS non tivo ningún efecto sobre o peso corporal (Fig. 3).
Cambios no peso corporal en ratas femias e machos despois da administración de NaHS (30 μM). Os datos preséntanse como media ± SEM e comparáronse mediante unha análise de varianza mixta bidireccional (dentro do intervalo) coa proba post hoc de Bonferroni. n = 5 de cada sexo en cada grupo.
As concentracións séricas de urea e creatinfosfato foron comparables nas ratas de control e nas tratadas con NaSH ao longo do estudo. Ademais, o tratamento con NaSH non afectou as concentracións séricas de urea nin creatincromo (Táboa 1).
As concentracións séricas totais de sulfuro foron comparables entre as ratas macho (8,1 ± 0,5 μM fronte a 9,3 ± 0,2 μM) e femias (9,1 ± 1,0 μM fronte a 6,1 ± 1,1 μM) de control e tratadas con NaHS. A administración de NaHS durante 14 días non tivo ningún efecto sobre os niveis séricos totais de sulfuro nin en ratas macho nin en femias (Fig. 4).
Cambios nas concentracións séricas totais de sulfuro en ratas macho e femia despois da administración de NaHS (30 μM). Os datos preséntanse como media ± SEM e comparáronse mediante unha análise de varianza mixta bidireccional (dentro-dentro) coa proba post hoc de Bonferroni. Para cada sexo, n = 5/grupo.
A principal conclusión deste estudo é que a auga potable que contén NaHS é inestable: só se pode detectar aproximadamente unha cuarta parte do contido total inicial de sulfuro 24 horas despois da mostraxe da punta e do interior das botellas de auga de ratas/ratos. Ademais, as ratas foron expostas a concentracións inestables de NaHS debido á perda de H2S na solución de NaHS, e a adición de NaHS á auga potable non afectou o peso corporal, a urea sérica e o cromo da creatinina, nin o sulfuro sérico total.
Neste estudo, a taxa de perda de H2S a partir de solucións de NaHS a 30 μM preparadas en auga potable foi de aproximadamente o 3 % por hora. Nunha solución tamponada (100 μM de sulfuro de sodio en 10 mM de PBS, pH 7,4), informouse de que a concentración de sulfuro diminuíu un 7 % ao longo do tempo durante 8 h11. Anteriormente, defendemos a administración intraperitoneal de NaHS ao informar de que a taxa de perda de sulfuro dunha solución de NaHS a 54 μM en auga potable foi de aproximadamente o 2,3 % por hora (4 %/hora nas primeiras 12 h e 1,4 %/hora nas últimas 12 h despois da preparación)8. Estudos anteriores43 atoparon unha perda constante de H2S a partir de solucións de NaHS, principalmente debido á volatilización e á oxidación. Mesmo sen a adición de burbullas, o sulfuro na solución madre pérdese rapidamente debido á volatilización do H2S11. Os estudos demostraron que durante o proceso de dilución, que leva uns 30–60 segundos, pérdese entre un 5 e un 10 % de H2S debido á evaporación6. Para evitar a evaporación do H2S da solución, os investigadores tomaron varias medidas, como axitar suavemente a solución12, cubrir a solución madre cunha película plástica6 e minimizar a exposición da solución ao aire, xa que a velocidade de evaporación do H2S depende da interface aire-líquido13. A oxidación espontánea do H2S prodúcese principalmente debido aos ións de metais de transición, especialmente o ferro férrico, que son impurezas da auga13. A oxidación do H2S provoca a formación de polisulfuros (átomos de xofre unidos por enlaces covalentes)11. Para evitar a súa oxidación, as solucións que conteñen H2S prepáranse en solventes desoxixenados44,45 e despois purgánse con argon ou nitróxeno durante 20–30 minutos para garantir a desoxixenación.11,12,37,44,45,46 O ácido dietilenetriaminpentaacético (DTPA) é un quelante de metais (10–4 M) que impide a autooxidación de HS- en solucións aeróbicas. En ausencia de DTPA, a taxa de autooxidación de HS- é de aproximadamente o 50 % durante aproximadamente 3 h a 25 °C37,47. Ademais, dado que a oxidación do 1e-sulfuro está catalizada por luz ultravioleta, a solución debe almacenarse en xeo e protexerse da luz11.
Como se mostra na Figura 5, o NaHS disóciase en Na+ e HS-6 cando se disolve en auga; esta disociación vén determinada polo pK1 da reacción, que depende da temperatura: pK1 = 3,122 + 1132/T, onde T varía de 5 a 30 °C e se mide en graos Kelvin (K), K = °C + 273,1548. O HS- ten un pK2 alto (pK2 = 19), polo que a pH < 96,49, o S2- non se forma ou se forma en cantidades moi pequenas. Pola contra, o HS- actúa como unha base e acepta H+ dunha molécula de H2O, e o H2O actúa como un ácido e convértese en H2S e OH-.
Formación de gas H2S disolto en solución de NaHS (30 µM). aq, solución acuosa; g, gas; l, líquido. Todos os cálculos supoñen que o pH da auga é de 7,0 e a temperatura da auga é de 20 °C. Creado con BioRender.com.
Malia as evidencias de que as solucións de NaHS son inestables, varios estudos en animais empregaron solucións de NaHS en auga potable como composto doador de H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 con duracións de intervención que oscilaron entre 1 e 21 semanas (Táboa 2). Durante estes estudos, a solución de NaHS renovouse cada 12 h, 15, 17, 18, 24, 25 h ou 24 h, 19, 20, 21, 22, 23 h. Os nosos resultados mostraron que as ratas estiveron expostas a concentracións inestables de fármacos debido á perda de H2S da solución de NaHS, e o contido de NaHS na auga potable das ratas fluctuou significativamente durante 12 ou 24 h (véxase a Figura 2). Dous destes estudos informaron de que os niveis de H2S na auga permaneceron estables durante 24 h22 ou que só se observaron perdas de H2S do 2 ao 3 % durante 12 h15, pero non proporcionaron datos nin detalles de medición que o respalden. Dous estudos demostraron que o pequeno diámetro das botellas de auga pode minimizar a evaporación do H2S15,19. Non obstante, os nosos resultados mostraron que isto só pode atrasar a perda de H2S dunha botella de auga en 2 horas en lugar de 12 a 24 horas. Ambos estudos sinalan que asumimos que o nivel de NaHS na auga potable non cambiou porque non observamos un cambio de cor na auga; polo tanto, a oxidación do H2S polo aire non foi significativa19,20. Sorprendentemente, este método subxectivo avalía a estabilidade do NaHS na auga en lugar de medir o cambio na súa concentración ao longo do tempo.
A perda de H2S nunha solución de NaHS está relacionada co pH e a temperatura. Como se indicou no noso estudo, a disolución de NaHS en auga produce a formación dunha solución alcalina50. Cando o NaHS se disolve en auga, a formación de gas H2S disolto depende do valor do pH6. Canto menor sexa o pH da solución, maior será a proporción de NaHS presente como moléculas de gas H2S e máis sulfuro se perderá da solución acuosa11. Ningún destes estudos informou sobre o pH da auga potable utilizada como disolvente para o NaHS. Segundo as recomendacións da OMS, que adoptan a maioría dos países, o pH da auga potable debe estar no rango de 6,5 a 8,551. Neste rango de pH, a taxa de oxidación espontánea do H2S aumenta aproximadamente dez veces13. A disolución de NaHS en auga neste rango de pH dará lugar a unha concentración de gas H2S disolto de 1 a 22,5 μM, o que enfatiza a importancia de controlar o pH da auga antes de disolver o NaHS. Ademais, o rango de temperaturas informado no estudo anterior (18–26 °C) daría lugar a un cambio na concentración de gas H2S disolto na solución de aproximadamente o 10 %, xa que os cambios de temperatura alteran o pK1 e os pequenos cambios no pK1 poden ter un impacto significativo na concentración de gas H2S disolto48. Ademais, a longa duración dalgúns estudos (5 meses)22, durante os cales se espera unha gran variabilidade de temperatura, tamén agrava este problema.
Todos os estudos, agás un21, empregaron unha solución de NaHS a 30 μM en auga potable. Para explicar a dose empregada (é dicir, 30 μM), algúns autores sinalaron que o NaHS na fase acuosa produce exactamente a mesma concentración de gas H2S e que o rango fisiolóxico de H2S é de 10 a 100 μM, polo que esta dose está dentro do rango fisiolóxico15,16. Outros explicaron que 30 μM de NaHS pode manter o nivel de H2S no plasma dentro do rango fisiolóxico, é dicir, 5–300 μM19,20. Consideramos unha concentración de NaHS en auga de 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), que se empregou nalgúns estudos para estudar os efectos do H2S. Podemos calcular que a concentración de gas H2S disolto é de 14,7 μM, o que supón aproximadamente o 50 % da concentración inicial de NaHS. Este valor é similar ao valor calculado por outros autores nas mesmas condicións13,48.
No noso estudo, a administración de NaHS non cambiou o peso corporal; este resultado é consistente cos resultados doutros estudos en ratos machos22,23 e ratas machos18; Non obstante, dous estudos informaron de que o NaSH restaurou a diminución do peso corporal en ratas nefrectomizadas24,26, mentres que outros estudos non informaron do efecto da administración de NaSH no peso corporal15,16,17,19,20,21,25. Ademais, no noso estudo, a administración de NaSH non afectou os niveis séricos de urea e cromo na creatinina, o que é consistente cos resultados doutro informe25.
O estudo descubriu que a adición de NaHS á auga potable durante 2 semanas non afectou as concentracións séricas totais de sulfuro en ratas macho e femia. Este achado é consistente cos resultados de Sen et al. (16): 8 semanas de tratamento con 30 μM de NaHS na auga potable non afectaron os niveis plasmáticos de sulfuro nas ratas de control; non obstante, informaron de que esta intervención restaurou a diminución dos niveis de H2S no plasma de ratos nefrectomizados. Li et al. (22) tamén informaron de que o tratamento con 30 μM de NaHS na auga potable durante 5 meses aumentou os niveis plasmáticos de sulfuro libre en ratos maiores nun 26 % aproximadamente. Outros estudos non informaron de cambios no sulfuro circulante despois da adición de NaHS á auga potable.
Sete estudos informaron do uso de Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 pero non proporcionaron máis detalles sobre a auga de hidratación, e cinco estudos non mencionaron a fonte de NaHS empregada nos seus métodos de preparación17,18,24,25,26. O NaHS é unha molécula hidratada e o seu contido de auga de hidratación pode variar, o que afecta á cantidade de NaHS necesaria para preparar unha solución dunha molaridade determinada. Por exemplo, o contido de NaHS no noso estudo foi de NaHS•1,3 H2O. Polo tanto, as concentracións reais de NaHS nestes estudos poden ser inferiores ás informadas.
«Como pode un composto de vida tan curta ter un efecto tan duradeiro?» Pozgay et al.21 formularon esta pregunta ao avaliar os efectos do NaHS na colite en ratos. Esperan que os estudos futuros poidan responder a esta pregunta e especular que as solucións de NaHS poden conter polisulfuros máis estables ademais do H2S e disulfuros que median o efecto do NaHS21. Outra posibilidade é que as concentracións moi baixas de NaHS que quedan na solución tamén poidan ter un efecto beneficioso. De feito, Olson et al. proporcionaron evidencia de que os niveis micromolares de H2S no sangue non son fisiolóxicos e deberían estar no rango nanomolar ou estar ausentes por completo13. O H2S pode actuar a través da sulfatación de proteínas, unha modificación postraducional reversible que afecta á función, estabilidade e localización de moitas proteínas52,53,54. De feito, en condicións fisiolóxicas, aproximadamente entre o 10 % e o 25 % de moitas proteínas do fígado están sulfiladas53. Ambos estudos recoñecen a rápida destrución do NaHS19,23 pero, sorprendentemente, afirman que «controlamos a concentración de NaHS na auga potable substituíndoo diariamente».23 Un estudo afirmou accidentalmente que «o NaHS é un doador estándar de H2S e úsase habitualmente na práctica clínica para substituír o propio H2S».18
A discusión anterior demostra que o NaHS se perde da solución por volatilización, oxidación e fotólise, e, polo tanto, fanse algunhas suxestións para reducir a perda de H2S da solución. En primeiro lugar, a evaporación do H2S depende da interface gas-líquido13 e do pH da solución11; polo tanto, para minimizar a perda por evaporación, o pescozo da botella de auga pode facerse o máis pequeno posible como se describiu anteriormente15,19, e o pH da auga pode axustarse a un límite superior aceptable (é dicir, 6,5–8,551) para minimizar a perda por evaporación11. En segundo lugar, a oxidación espontánea do H2S ocorre debido aos efectos do osíxeno e á presenza de ións de metais de transición na auga potable13, polo que a desoxixenación da auga potable con argón ou nitróxeno44,45 e o uso de quelantes metálicos37,47 poden reducir a oxidación dos sulfuros. En terceiro lugar, para evitar a fotodescomposición do H2S, as botellas de auga poden envolverse con papel de aluminio; Esta práctica tamén se aplica a materiais fotosensibles como a estreptozotocina55. Finalmente, os sales de sulfuro inorgánico (NaHS, Na2S e CaS) poden administrarse por sonda en lugar de disolverse en auga potable como se informou anteriormente56,57,58; os estudos demostraron que o sulfuro de sodio radioactivo administrado por sonda a ratas absórbese ben e distribúese por practicamente todos os tecidos59. Ata a data, a maioría dos estudos administraron sales de sulfuro inorgánico por vía intraperitoneal; non obstante, esta vía raramente se usa en entornos clínicos60. Por outra banda, a vía oral é a vía de administración máis común e preferida en humanos61. Polo tanto, recomendamos avaliar os efectos dos doadores de H2S en roedores mediante sonda oral.
Unha limitación é que medimos o sulfuro en solución acuosa e soro usando o método MB. Os métodos para medir o sulfuro inclúen a titulación de iodo, a espectrofotometría, o método electroquímico (potenciometría, amperometría, método coulométrico e método amperométrico) e a cromatografía (cromatografía de gases e cromatografía líquida de alta resolución), entre os cales o método máis utilizado é o método espectrofotométrico MB62. Unha limitación do método MB para medir o H2S en mostras biolóxicas é que mide todos os compostos que conteñen xofre e non o H2S63 libre porque se realiza en condicións ácidas, o que resulta na extracción de xofre da fonte biolóxica64. Non obstante, segundo a Asociación Americana de Saúde Pública, o MB é o método estándar para medir o sulfuro na auga65. Polo tanto, esta limitación non afecta os nosos principais resultados sobre a inestabilidade das solucións que conteñen NaHS. Ademais, no noso estudo, a recuperación das medicións de sulfuro en mostras de auga e soro que conteñen NaHS foi do 91 % e o 93 %, respectivamente. Estes valores están en liña cos rangos informados anteriormente (77–92)66, o que indica unha precisión analítica aceptable42. Cómpre sinalar que empregamos ratas machos e femias de acordo coas directrices dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para evitar unha dependencia excesiva de estudos con animais só con machos nos estudos preclínicos67 e para incluír ratas machos e femias sempre que fose68. Este punto foi salientado por outros69,70,71.
En conclusión, os resultados deste estudo indican que as solucións de NaHS preparadas a partir de auga potable non se poden empregar para xerar H2S debido á súa inestabilidade. Esta vía de administración expoñería os animais a niveis de NaHS inestables e inferiores aos esperados; polo tanto, os achados poden non ser aplicables aos humanos.
Os conxuntos de datos empregados e/ou analizados durante o presente estudo están dispoñibles a través do autor correspondente se se solicitan con razoable solicitude.
Szabo, K. Cronoloxía da investigación do sulfuro de hidróxeno (H2S): de toxina ambiental a mediador biolóxico. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. e Kimura, H. Posible función do sulfuro de hidróxeno como neuromodulador endóxeno. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. e Papapetropoulos, A. Papel fisiolóxico do sulfuro de hidróxeno nas células, tecidos e órganos dos mamíferos. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB e Kashfi, K. A promesa en evolución dos sistemas de administración celular de óxido nítrico e sulfuro de hidróxeno: unha nova era da medicina personalizada. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. A administración a longo prazo dun doador de sulfuro de hidróxeno de liberación lenta pode previr lesións por isquemia/reperfusión miocárdica. Informes científicos 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM e Hermann, A. A fosforilación dos canais BK regula a sensibilidade ao sulfuro de hidróxeno (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM e Hermann, A. O sulfuro de hidróxeno mellora a actividade dos canais de potasio activados por calcio (BK) nas células tumorais da hipófise de rata. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. O sulfuro de hidróxeno mellora o efecto protector do nitrito contra a lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratas con diabetes tipo 2. Óxido nítrico 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Tendencias na química dos doadores de H2S e o seu impacto nas enfermidades cardiovasculares. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF e Olson, KR (2012). Perdas pasivas de sulfuro de hidróxeno en experimentos biolóxicos. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Aspectos químicos das medicións de sulfuro de hidróxeno en mostras fisiolóxicas. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Determinación espectrofotométrica de sulfuro de hidróxeno en augas naturais. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Formación práctica en química e bioloxía do sulfuro de hidróxeno. “Antioxidants”. Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).