Anteriormente informamos de que os niveis séricos do metabolito do triptófano derivado do intestino, o ácido indol-3-propiónico (IPA), son máis baixos en pacientes con fibrose hepática. Neste estudo, investigamos o transcriptoma e o metiloma do ADN en fígados obesos en relación cos niveis séricos de IPA, así como o papel do IPA na indución da inactivación fenotípica das células estreladas hepáticas (HSC) in vitro.
O estudo incluíu 116 pacientes obesos sen diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (idade 46,8 ± 9,3 anos; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m²) que se someteron a cirurxía bariátrica no Centro de Cirurxía Bariátrica de Kuopio (KOBS). Os niveis circulantes de IPA medíronse mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), realizouse unha análise do transcriptoma hepático mediante secuenciación de ARN total e unha análise de metilación do ADN utilizando o Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Para os experimentos in vitro utilizáronse células estreladas hepáticas humanas (LX-2).
Os niveis séricos de IPA correlacionáronse coa expresión de xenes implicados nas vías apoptóticas, mitofáxicas e de lonxevidade no fígado. O xene AKT serina/treonina quinase 1 (AKT1) foi o xene de interacción máis abundante e dominante nos perfís de transcritos hepáticos e metilación do ADN. O tratamento con IPA induciu a apoptose, diminuíu a respiración mitocondrial e alterou a morfoloxía celular e a dinámica mitocondrial ao modular a expresión de xenes que se sabe que regulan a fibrose, a apoptose e a supervivencia das células LX-2.
En conxunto, estes datos apoian que o IPA ten potenciais efectos terapéuticos e pode inducir a apoptose e cambiar o fenotipo das HSC cara a un estado inactivo, ampliando así a posibilidade de inhibir a fibrose hepática ao interferir coa activación das HSC e o metabolismo mitocondrial.
A prevalencia da obesidade e da síndrome metabólica asociouse a unha incidencia crecente de esteatose hepática asociada ao metabolismo (EMA); a enfermidade afecta entre o 25 % e o 30 % da poboación xeral [1]. A principal consecuencia da etioloxía da EMA é a fibrose hepática, un proceso dinámico caracterizado pola acumulación continua de matriz extracelular fibrosa (MEC) [2]. As principais células implicadas na fibrose hepática son as células estreladas hepáticas (CHE), que presentan catro fenotipos coñecidos: laescentes, activadas, inactivadas e senescentes [3, 4]. As CHE poden activarse e transdiferenciarse dunha forma laescente a células proliferativas de tipo fibroblasto con altas demandas enerxéticas, cunha maior expresión de α-actina do músculo liso (α-SMA) e coláxeno de tipo I (Col-I) [5, 6]. Durante a reversión da fibrose hepática, as CHE activadas elimínanse mediante apoptose ou inactivación. Estes procesos inclúen a regulación á baixa dos xenes fibroxénicos e a modulación dos xenes de prosupervivencia (como as vías de sinalización NF-κB e PI3K/Akt) [7, 8], así como cambios na dinámica e función mitocondrial [9].
Descubriuse que os niveis séricos do metabolito do triptófano, o ácido indol-3-propiónico (IPA), producido no intestino, diminuíron en enfermidades metabólicas humanas, incluída a MASLD [10–13]. O IPA está asociado á inxesta de fibra alimentaria, é coñecido polos seus efectos antioxidantes e antiinflamatorios e atenúa o fenotipo da esteatohepatite non alcohólica (NASH) inducida pola dieta in vivo e in vitro [11–14]. Algunhas evidencias proveñen do noso estudo anterior, que demostrou que os niveis séricos de IPA eran máis baixos en pacientes con fibrose hepática que en pacientes obesos sen fibrose hepática no Estudo de Cirurxía Bariátrica de Kuopio (KOBS). Ademais, demostramos que o tratamento con IPA podería reducir a expresión de xenes que son marcadores clásicos da adhesión celular, a migración celular e a activación das células nai hematopoéticas nun modelo de células estreladas hepáticas humanas (LX-2) e é un posible metabolito hepatoprotector [15]. Non obstante, segue sen estar claro como o IPA induce a regresión da fibrose hepática ao activar a apoptose das HSC e a bioenerxética mitocondrial.
Aquí, demostramos que o IPA sérico está asociado coa expresión de xenes enriquecidos en vías de apoptose, mitofaxia e lonxevidade no fígado de individuos obesos pero sen diabetes de tipo 2 (KOBS). Ademais, descubrimos que o IPA pode inducir a eliminación e degradación das células nai hematopoéticas activadas (HSC) a través da vía de inactivación. Estes resultados revelan un novo papel para o IPA, o que o converte nun posible obxectivo terapéutico para promover a regresión da fibrose hepática.
Un estudo previo na cohorte KOBS mostrou que os pacientes con fibrose hepática tiñan niveis circulantes de IPA máis baixos en comparación cos pacientes sen fibrose hepática [15]. Para descartar o posible efecto de confusión da diabetes tipo 2, recrutamos 116 pacientes obesos sen diabetes tipo 2 (idade media ± DE: 46,8 ± 9,3 anos; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Táboa 1) do estudo KOBS en curso como poboación do estudo [16]. Todos os participantes deron o seu consentimento informado por escrito e o protocolo do estudo foi aprobado polo Comité de Ética do Hospital do Condado de Savo Norte de acordo coa Declaración de Helsinqui (54/2005, 104/2008 e 27/2010).
As mostras de biopsia hepática obtivéronse durante a cirurxía bariátrica e foron avaliadas histoloxicamente por patólogos experimentados segundo os criterios descritos previamente [17, 18]. Os criterios de avaliación resúmense na Táboa Suplementaria S1 e xa foron descritos previamente [19].
As mostras de soro en xexún analizáronse mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) non dirixida para a análise metabolómica (n = 116). As mostras analizáronse empregando un sistema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Alemaña) como se describiu anteriormente19. A identificación do alcohol isopropílico (IPA) baseouse no tempo de retención e na comparación do espectro MS/MS con estándares puros. A intensidade do sinal de IPA (área do pico) considerouse en todas as análises posteriores [20].
A secuenciación de ARN hepático completo realizouse empregando Illumina HiSeq 2500 e os datos foron preprocesados ​​como se describiu anteriormente [19, 21, 22]. Realizamos unha análise de expresión diferencial dirixida de transcritos que afectan á función/bioxénese mitocondrial empregando 1957 xenes seleccionados da base de datos MitoMiner 4.0 [23]. A análise de metilación do ADN hepático realizouse empregando o Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, EUA) coa mesma metodoloxía descrita anteriormente [24, 25].
O profesor Stefano Romeo proporcionou amablemente células estreladas hepáticas humanas (LX-2) e cultiváronse e mantivéronse en medio DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1 % Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2 % FBS; Gibco, 10270-106). Para seleccionar a dose de traballo de IPA, as células LX-2 tratáronse con diferentes concentracións de IPA (10 μM, 100 μM e 1 mM; Sigma, 220027) en medio DMEM/F12 durante 24 h. Ademais, para investigar a capacidade do IPA para inactivar as HSC, as células LX-2 cotratáronse con 5 ng/ml de TGF-β1 (sistemas de R&D, 240-B-002/CF) e 1 mM de IPA en medio sen soro durante 24 h. Para os controis de vehículo correspondentes, utilizouse HCL 4 nM que contiña 0,1 % de BSA para o tratamento con TGF-β1 e 0,05 % de DMSO para o tratamento con IPA, e ambos os dous utilizáronse conxuntamente para o tratamento combinado.
A apoptose avaliouse empregando o kit de detección de apoptose FITC Annexin V con 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, EUA, Cat# 640922) segundo as instrucións do fabricante. En resumo, as células LX-2 (1 × 105 células/pocillo) cultiváronse durante a noite en placas de 12 pocillo e despois tratáronse con doses múltiples de IPA ou IPA e TGF-β1. Ao día seguinte, recolléronse as células flotantes e adherentes, tripsinizáronse, laváronse con PBS, resuspendiéronse en tampón de unión á anexina V e incubáronse con FITC-anexina V e 7-AAD durante 15 minutos.
As mitocondrias das células vivas foron tinguidas para determinar a súa actividade oxidativa empregando Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Para os ensaios de MTR, as células LX-2 foron incubadas a densidades iguais con IPA e TGF-β1. Despois de 24 h, as células vivas foron tripsinizadas, lavadas con PBS e logo incubadas con 100 μM de MTR en medio sen soro a 37 °C durante 20 min como se describiu anteriormente [26]. Para a análise da morfoloxía das células vivas, o tamaño das células e a complexidade citoplasmática analizáronse empregando parámetros de dispersión directa (FSC) e dispersión lateral (SSC), respectivamente.
Todos os datos (30.000 eventos) foron adquiridos empregando NovoCyte Quanteon (Agilent) e analizados co software NovoExpress® 1.4.1 ou FlowJo V.10.
A taxa de consumo de osíxeno (OCR) e a taxa de acidificación extracelular (ECAR) medíronse en tempo real empregando un analizador de fluxo extracelular Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipado cun Seahorse XF Cell Mito Stress segundo as instrucións do fabricante. En resumo, sementáronse 2 × 104 células LX-2/pociño en placas de cultivo celular XF96. Despois da incubación durante a noite, as células tratáronse con isopropanol (IPA) e TGF-β1 (Métodos suplementarios 1). A análise de datos realizouse empregando o software Seahorse XF Wave, que inclúe o xerador de informes de probas de fenotipo de enerxía celular Seahorse XF. A partir disto, calculouse un índice de saúde bioenerxética (BHI) [27].
O ARN total transcribiuse a ADNc. Para coñecer os métodos específicos, consulte a referencia [15]. Os niveis de ARNm da proteína ácida ribosómica P0 humana 60S (RPLP0) e da ciclofilina A1 (PPIA) empregáronse como controis xénicos constitutivos. O sistema de PCR en tempo real QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Países Baixos) utilizouse co kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) ou o kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), e o pregamento relativo da expresión xénica calculouse utilizando parámetros comparativos do ciclo de valores Ct (ΔΔCt) e o método ∆∆Ct. Os detalles dos cebadores ofrécense nas táboas suplementarias S2 e S3.
O ADN nuclear (ADNnc) e o ADN mitocondrial (ADNmt) extraéronse empregando o kit de sangue e tecidos DNeasy (Qiagen) como se describiu anteriormente [28]. A cantidade relativa de ADNmt calculouse calculando a proporción de cada rexión diana de ADNmt coa media xeométrica das tres rexións de ADN nuclear (ADNmt/ADNnc), como se detalla nos Métodos suplementarios 2. Os detalles dos cebadores para o ADNmt e o ADNnc ofrécense na Táboa suplementaria S4.
As células vivas foron tinguidas con Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) para visualizar as redes mitocondriais intercelulares e intracelulares. As células LX-2 (1 × 104 células/pocillo) cultiváronse en láminas de vidro en placas de cultivo con fondo de vidro correspondentes (Ibidi GmbH, Martinsried, Alemaña). Despois de 24 h, as células LX-2 vivas incubáronse con 100 μM de MTR durante 20 min a 37 °C e os núcleos celulares foron tinguidos con DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) como se describiu anteriormente [29]. As redes mitocondriais visualizáronse cun microscopio invertido Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemaña) equipado cun módulo confocal Zeiss LSM 800 a 37 °C nunha atmosfera humidificada con 5 % de CO2 usando un obxectivo de 63 × NA 1.3. Adquirimos dez imaxes da serie Z para cada tipo de mostra. Cada serie Z contén 30 seccións, cada unha cun grosor de 9,86 μm. Para cada mostra, adquiríronse imaxes de dez campos de visión diferentes usando o software ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemaña) e realizouse unha análise da morfoloxía mitocondrial usando o software ImageJ (v1.54d) [30, 31] segundo os parámetros detallados nos Métodos Suplementarios 3.
As células fixáronse con glutaraldehído ao 2 % en tampón fosfato 0,1 M, seguido de fixación cunha solución de tetróxido de osmio ao 1 % (Sigma Aldrich, MO, EUA), deshidratáronse gradualmente con acetona (Merck, Darmstadt, Alemaña) e finalmente incrustáronse en resina epoxi. Preparáronse seccións ultrafinas e tinguíronse con acetato de uranilo ao 1 % (Merck, Darmstadt, Alemaña) e citrato de chumbo ao 1 % (Merck, Darmstadt, Alemaña). As imaxes ultraestruturais obtivéronse usando un microscopio electrónico de transmisión JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Toquio, Xapón) a unha tensión de aceleración de 80 kV.
A morfoloxía das células LX-2 tratadas con IPA durante 24 h analizouse mediante microscopía de contraste de fase a un aumento de 50x usando un microscopio de luz invertida Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 e AxioCam MRm, Jena, Alemaña).
Os datos clínicos expresáronse como media ± desviación estándar ou mediana (rango intercuartílico: IQR). Utilizouse unha análise unidireccional da varianza (variables continuas) ou a proba χ² (variables categóricas) para comparar as diferenzas entre os tres grupos de estudo. A taxa de falsos positivos (FDR) utilizouse para corrixir as probas múltiples, e os xenes con FDR < 0,05 consideráronse estatisticamente significativos. Utilizouse a análise de correlación de Spearman para correlacionar a metilación do ADN CpG coa intensidade do sinal IPA, con valores p nominais (p < 0,05) reportados.
A análise de rutas xenéticas realizouse empregando unha ferramenta de análise de conxuntos de xenes baseada na web (WebGestalt) para 268 transcritos (p nominal < 0,01), 119 transcritos asociados a mitocondrias (p nominal < 0,05) e 4350 CpG de 3093 transcritos hepáticos que estaban asociados cos niveis séricos circulantes de IPA. A ferramenta Venny DB (versión 2.1.0) dispoñible gratuitamente utilizouse para atopar xenes superpostos e StringDB (versión 11.5) utilizouse para visualizar as interaccións proteína-proteína.
Para o experimento LX-2, as mostras foron analizadas para comprobar a súa normalidade mediante a proba de D'Agostino-Pearson. Os datos obtivéronse de polo menos tres réplicas biolóxicas e sometéronse a ANOVA unidireccional coa proba post hoc de Bonferroni. Un valor p inferior a 0,05 considerouse estatisticamente significativo. Os datos preséntanse como media ± desviación estándar e o número de experimentos indícase en cada figura. Todas as análises e gráficos realizáronse mediante o software estatístico GraphPad Prism 8 para Windows (GraphPad Software Inc., versión 8.4.3, San Diego, EUA).
En primeiro lugar, investigamos a asociación dos niveis séricos de IPA cos transcritos de fígado, corpo enteiro e mitocondrial. No perfil total de transcritos, o xene máis forte asociado cos niveis séricos de IPA foi MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; proteína quinase activada por mitóxenos - proteína quinase activada por mitóxenos 3); no perfil de transcritos relacionado coas mitocondrias, o xene asociado máis forte foi AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serina/treonina quinase 1) (ficheiro adicional 1 e ficheiro adicional 2).
Despois analizamos os transcritos globais (n = 268; p < 0,01) e os transcritos asociados ás mitocondrias (n = 119; p < 0,05), identificando finalmente a apoptose como a vía canónica máis significativa (p = 0,0089). Para os transcritos mitocondriais asociados cos niveis séricos de IPA, centrámonos na apoptose (FDR = 0,00001), a mitofaxia (FDR = 0,00029) e as vías de sinalización do TNF (FDR = 0,000006) (Figura 1A, Táboa 2 e Figuras Suplementarias 1A-B).
Análise superposta de transcritos globais asociados a mitocondrias e metilación do ADN no fígado humano en asociación cos niveis séricos de IPA. A representa 268 transcritos globais, 119 transcritos asociados a mitocondrias e transcritos de ADN metilados que están mapeados a 3092 sitios CpG asociados cos niveis séricos de IPA (valores p < 0,01 para transcritos globais e ADN metilado, e valores p < 0,05 para transcritos mitocondriais). Os principais transcritos superpostos móstranse no medio (AKT1 e YKT6). B O mapa de interacción dos 13 xenes coa puntuación de interacción máis alta (0,900) con outros xenes construíuse a partir dos 56 xenes superpostos (rexión da liña negra) que estaban significativamente asociados cos niveis séricos de IPA usando a ferramenta en liña StringDB. Verde: Xenes mapeados ao compoñente celular de Gene Ontology (GO): mitocondrias (GO:0005739). AKT1 é a proteína coa puntuación máis alta (0,900) para as interaccións con outras proteínas baseadas nos datos (baseados en minería de texto, experimentos, bases de datos e coexpresión). Os nodos da rede representan proteínas e as arestas representan conexións entre proteínas.
Dado que os metabolitos da microbiota intestinal poden regular a composición epixenética a través da metilación do ADN [32], investigamos se os niveis séricos de IPA estaban asociados coa metilación do ADN hepático. Descubrimos que os dous principais sitios de metilación asociados cos niveis séricos de IPA estaban preto da rexión 3 rica en prolina-serina (C19orf55) e do membro 6 (pequeno) da familia de proteínas de choque térmico B (HSPB6) (ficheiro adicional 3). A metilación do ADN de 4350 CpG (p < 0,01) correlacionouse cos niveis séricos de IPA e enriqueceuse nas vías reguladoras da lonxevidade (p = 0,006) (Figura 1A, Táboa 2 e Figura Suplementaria 1C).
Para comprender os mecanismos biolóxicos subxacentes ás asociacións entre os niveis séricos de IPA, os transcritos globais, os transcritos asociados ás mitocondrias e a metilación do ADN no fígado humano, realizamos unha análise de superposición dos xenes identificados na análise de vías previa (Figura 1A). Os resultados da análise de enriquecemento de vías dos 56 xenes superpostos (dentro da liña negra na Figura 1A) mostraron que a vía da apoptose (p = 0,00029) destacou dous xenes comúns ás tres análises: AKT1 e YKT6 (homólogo de YKT6 v-SNARE), como se mostra no diagrama de Venn (Figura suplementaria 2 e Figura 1A). Curiosamente, descubrimos que AKT1 (cg19831386) e YKT6 (cg24161647) estaban correlacionados positivamente cos niveis séricos de IPA (ficheiro adicional 3). Para identificar posibles interaccións proteicas entre produtos xénicos, seleccionamos 13 xenes coa puntuación de rexión común máis alta (0,900) entre 56 xenes superpostos como entrada e construímos un mapa de interacción. Segundo o nivel de confianza (confianza marxinal), o xene AKT1 coa puntuación máis alta (0,900) estaba no cumio (Figura 1B).
Baseándonos na análise da ruta celular, descubrimos que a apoptose era a principal, polo que investigamos se o tratamento con IPA afectaría á apoptose das HSC in vitro. Anteriormente demostramos que diferentes doses de IPA (10 μM, 100 μM e 1 mM) non eran tóxicas para as células LX-2 [15]. Este estudo mostrou que o tratamento con IPA a 10 μM e 100 μM aumentou o número de células viables e necróticas. Non obstante, en comparación co grupo de control, a viabilidade celular diminuíu a unha concentración de IPA de 1 mM, mentres que a taxa de necrose celular permaneceu sen cambios (Figura 2A, B). A continuación, para atopar a concentración óptima para inducir a apoptose nas células LX-2, probamos IPA de 10 μM, 100 μM e 1 mM durante 24 h (Figura 2A-E e Figura Suplementaria 3A-B). Curiosamente, o IPA de 10 μM e 100 μM diminuíu a taxa de apoptose (%); porén, o IPA de 1 mM aumentou a apoptose tardía e a taxa de apoptose (%) en comparación co control, polo que foi elixido para experimentos posteriores (Figuras 2A–D).
O IPA induce a apoptose das células LX-2. Empregouse o método de dobre tinción con anexina V e 7-AAD para cuantificar a taxa de apoptose e a morfoloxía celular mediante citometría de fluxo. As células BA incubáronse con 10 μM, 100 μM e 1 mM de IPA durante 24 h ou con F–H TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM de IPA en medio sen soro durante 24 h. A: células vivas (anexina V -/ 7AAD-); B: células necróticas (anexina V -/ 7AAD+); C, F: temperá (anexina V +/ 7AAD-); D, G: tardía (anexina V+/7AAD.+); E, H: porcentaxe de células apoptóticas temperás e tardías totais en taxa de apoptose (%). Os datos exprésanse como media ± DE, n = 3 experimentos independentes. As comparacións estatísticas realizáronse mediante ANOVA unidireccional coa proba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Como xa demostramos previamente, 5 ng/ml de TGF-β1 pode inducir a activación de HSC ao aumentar a expresión de xenes marcadores clásicos [15]. As células LX-2 foron tratadas con 5 ng/ml de TGF-β1 e 1 mM de IPA en combinación (Fig. 2E-H). O tratamento con TGF-β1 non cambiou a taxa de apoptose; non obstante, o cotratamento con IPA aumentou a apoptose tardía e a taxa de apoptose (%) en comparación co tratamento con TGF-β1 (Fig. 2E-H). Estes resultados indican que 1 mM de IPA pode promover a apoptose en células LX-2 independentemente da indución de TGF-β1.
Investigamos máis a fondo o efecto do IPA na respiración mitocondrial en células LX-2. Os resultados mostraron que 1 mM de IPA reduciu os parámetros da taxa de consumo de osíxeno (OCR): respiración non mitocondrial, respiración basal e máxima, fuga de protóns e produción de ATP en comparación co grupo de control (Figura 3A, B), mentres que o índice de saúde bioenerxética (BHI) non cambiou.
O IPA reduce a respiración mitocondrial nas células LX-2. A curva de respiración mitocondrial (OCR) preséntase como parámetros de respiración mitocondrial (respiración non mitocondrial, respiración basal, respiración máxima, fuga de protóns, xeración de ATP, SRC e BHI). As células A e B incubáronse con 10 μM, 100 μM e 1 mM de IPA durante 24 h, respectivamente. As células C e D incubáronse con TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM de IPA en medio sen soro durante 24 h, respectivamente. Todas as medicións normalizáronse ao contido de ADN usando o kit CyQuant. BHI: índice de saúde bioenerxética; SRC: capacidade de reserva respiratoria; OCR: taxa de consumo de osíxeno. Os datos preséntanse como media ± desviación estándar (DE), n = 5 experimentos independentes. As comparacións estatísticas realizáronse usando ANOVA unidireccional e proba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; e ***p < 0,001
Para comprender mellor o efecto do IPA no perfil bioenerxético das células LX-2 activadas por TGF-β1, analizamos a fosforilación oxidativa mitocondrial mediante OCR (Fig. 3C, D). Os resultados mostraron que o tratamento con TGF-β1 podía reducir a respiración máxima, a capacidade de reserva respiratoria (SRC) e o BHI en comparación co grupo de control (Fig. 3C, D). Ademais, o tratamento combinado diminuíu a respiración basal, a fuga de protóns e a produción de ATP, pero o SRC e o BHI foron significativamente maiores que os tratados con TGF-β1 (Fig. 3C, D).
Tamén realizamos a "Proba de fenotipo de enerxía celular" proporcionada polo software Seahorse (Fig. suplementaria 4A-D). Como se mostra na Fig. suplementaria 3B, os potenciais metabólicos tanto de OCR como de ECAR diminuíron despois do tratamento con TGF-β1; non obstante, non se observou ningunha diferenza nos grupos de tratamento combinado e con IPA en comparación co grupo de control. Ademais, os niveis basais e de estrés de OCR diminuíron despois do tratamento combinado e con IPA en comparación co grupo de control (Fig. suplementaria 4C). Curiosamente, observouse un patrón similar coa terapia combinada, onde non se observou ningún cambio nos niveis basais e de estrés de ECAR en comparación co tratamento con TGF-β1 (Fig. suplementaria 4C). Nas HSC, a redución da fosforilación oxidativa mitocondrial e a capacidade do tratamento combinado para restaurar SCR e BHI despois da exposición ao tratamento con TGF-β1 non alteraron o potencial metabólico (OCR e ECAR). En conxunto, estes resultados indican que o IPA pode reducir a bioenerxética nas HSC, o que suxire que o IPA pode inducir un perfil enerxético máis baixo que despraza o fenotipo das HSC cara á inactivación (Figura suplementaria 4D).
O efecto do IPA na dinámica mitocondrial investigouse mediante a cuantificación tridimensional da morfoloxía mitocondrial e as conexións de rede, así como a tinguidura MTR (Figura 4 e Figura suplementaria 5). A Figura 4 mostra que, en comparación co grupo de control, o tratamento con TGF-β1 diminuíu a superficie media, o número de ramas, a lonxitude total de ramas e o número de unións de ramas (Figura 4A e B) e cambiou a proporción de mitocondrias de morfoloxía esférica a intermedia (Figura 4C). Só o tratamento con IPA diminuíu o volume mitocondrial medio e cambiou a proporción de mitocondrias de morfoloxía esférica a intermedia en comparación co grupo de control (Figura 4A). En contraste, a esfericidade, a lonxitude media das ramas e a actividade mitocondrial avaliadas mediante MTR dependente do potencial da membrana mitocondrial (Figura 4A e E) permaneceron sen cambios e estes parámetros non difiren entre os grupos. En conxunto, estes resultados suxiren que o tratamento con TGF-β1 e IPA parece modular a forma e o tamaño mitocondrial, así como a complexidade da rede en células LX-2 vivas.
O IPA altera a dinámica mitocondrial e a abundancia de ADN mitocondrial en células LX-2. A. Imaxes confocais representativas de células LX-2 vivas incubadas con TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM de IPA durante 24 h en medio sen soro que mostran redes mitocondriais tinguidas con Mitotracker™ Red CMXRos e núcleos tinguidos de azul con DAPI. Todos os datos contiñan polo menos 15 imaxes por grupo. Adquirimos 10 imaxes de pila Z para cada tipo de mostra. Cada secuencia do eixe Z contiña 30 cortes, cada un cun grosor de 9,86 μm. Barra de escala: 10 μm. B. Obxectos representativos (só mitocondrias) identificados aplicando un limiar adaptativo á imaxe. Realizouse unha análise cuantitativa e unha comparación das conexións da rede morfolóxica mitocondrial para todas as células de cada grupo. C. Frecuencia das relacións de forma mitocondrial. Os valores próximos a 0 indican formas esféricas e os valores próximos a 1 indican formas filamentosas. D O contido de ADN mitocondrial (ADNmt) determinouse como se describe en Materiais e Métodos. A análise de E Mitotracker™ Red CMXRos realizouse mediante citometría de fluxo (30 000 eventos) como se describe en Materiais e métodos. Os datos preséntanse como media ± desviación estándar, n = 3 experimentos independentes. As comparacións estatísticas realizáronse mediante ANOVA unidireccional e proba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Despois analizamos o contido de ADNmt nas células LX-2 como indicador do número de mitocondrias. En comparación co grupo de control, o contido de ADNmt aumentou no grupo tratado con TGF-β1 (Figura 4D). En comparación co grupo tratado con TGF-β1, o contido de ADNmt diminuíu no grupo de tratamento combinado (Figura 4D), o que suxire que o IPA pode reducir o contido de ADNmt e posiblemente o número de mitocondrias, así como a respiración mitocondrial (Figura 3C). Ademais, o IPA pareceu reducir o contido de ADNmt no tratamento combinado, pero non afectou a actividade mitocondrial mediada por MTR (Figuras 4A–C).
Investigamos a asociación do IPA cos niveis de ARNm de xenes asociados coa fibrose, a apoptose, a supervivencia e a dinámica mitocondrial en células LX-2 (Figura 5A–D). En comparación co grupo de control, o grupo tratado con TGF-β1 mostrou unha maior expresión de xenes como a cadea α2 de coláxeno tipo I (COL1A2), a α-actina do músculo liso (αSMA), a metaloproteinase de matriz 2 (MMP2), o inhibidor tisular da metaloproteinase 1 (TIMP1) e o xene similar á dinamina 1 (DRP1), o que indica un aumento da fibrose e da activación. Ademais, en comparación co grupo de control, o tratamento con TGF-β1 reduciu os niveis de ARNm do receptor nuclear de pregnano X (PXR), a caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, o inhibidor da α das células B, o potenciador do péptido lixeiro do xene do factor nuclear κ (NFκB1A) e o inhibidor da subunidade β da quinase do factor nuclear κB (IKBKB) (Figura 5A–D). En comparación co tratamento con TGF-β1, o tratamento combinado con TGF-β1 e IPA reduciu a expresión de COL1A2 e MMP2, pero aumentou os niveis de ARNm de PXR, TIMP1, linfoma de células B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β e IKBKB. O tratamento con IPA diminuíu significativamente a expresión de MMP2, proteína X asociada a Bcl-2 (BAX), AKT1, proteína da atrofia óptica 1 (OPA1) e proteína de fusión mitocondrial 2 (MFN2), mentres que a expresión de CASP8, NFκB1A, NFκB1B e IKBKB aumentou en comparación co grupo de control. Non obstante, non se atoparon diferenzas na expresión da caspase-3 (CASP3), o factor activador da peptidase apoptótica 1 (APAF1), a proteína de fusión mitocondrial 1 (MFN1) e a proteína de fisión 1 (FIS1). Conxuntamente, estes resultados suxiren que o tratamento con IPA modula a expresión de xenes asociados coa fibrose, a apoptose, a supervivencia e a dinámica mitocondrial. Os nosos datos suxiren que o tratamento con IPA reduce a fibrose nas células LX-2; ao mesmo tempo, estimula a supervivencia ao cambiar o fenotipo cara á inactivación.
O IPA modula a expresión de xenes de fibroblastos, apoptóticos, de viabilidade e de dinámica mitocondrial en células LX-2. Os histogramas mostran a expresión do ARNm en relación co control endóxeno (RPLP0 ou PPIA) despois de que as células LX-2 fosen inducidas con TGF-β1 e IPA en medio sen soro durante 24 h. A indica fibroblastos, B indica células apoptóticas, C indica células superviventes e D indica a expresión xénica da dinámica mitocondrial. Os datos preséntanse como media ± desviación estándar (DE), n = 3 experimentos independentes. As comparacións estatísticas realizáronse mediante ANOVA unidireccional e proba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Despois, os cambios no tamaño celular (FSC-H) e na complexidade citoplasmática (SSC-H) avaliáronse mediante citometría de fluxo (Figura 6A, B), e os cambios na morfoloxía celular despois do tratamento con IPA avaliáronse mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) e microscopía de contraste de fase (Figura suplementaria 6A-B). Como se esperaba, as células do grupo tratado con TGF-β1 aumentaron de tamaño en comparación co grupo de control (Figura 6A, B), mostrando a expansión clásica do retículo endoplasmático rugoso (ER*) e dos fagolisosomas (P), o que indica a activación das células nai hematopoéticas (HSC) (Figura suplementaria 6A). Non obstante, en comparación co grupo tratado con TGF-β1, o tamaño celular, a complexidade citoplasmática (Fig. 6A, B) e o contido de ER* diminuíron no grupo de tratamento combinado con TGF-β1 e IPA (Fig. suplementaria 6A). Ademais, o tratamento con IPA reduciu o tamaño das células, a complexidade citoplasmática (Figs. 6A, B), o contido de P e ER* (Fig. suplementaria 6A) en comparación co grupo de control. Ademais, o contido de células apoptóticas aumentou despois de 24 horas de tratamento con IPA en comparación co grupo de control (frechas brancas, Fig. suplementaria 6B). Conxuntamente, estes resultados suxiren que 1 mM de IPA pode estimular a apoptose das HSC e reverter os cambios nos parámetros morfolóxicos celulares inducidos por TGF-β1, regulando así o tamaño e a complexidade das células, o que pode estar asociado coa inactivación de HSC.
O IPA altera o tamaño celular e a complexidade citoplasmática nas células LX-2. Imaxes representativas da análise por citometría de fluxo. A análise empregou unha estratexia de activación específica para as células LX-2: SSC-A/FSC-A para definir a poboación celular, FSC-H/FSC-A para identificar dobletes e SSC-H/FSC-H para a análise do tamaño e a complexidade celular. As células incubáronse con TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM de IPA en medio sen soro durante 24 h. As células LX-2 distribuíronse no cuadrante inferior esquerdo (SSC-H-/FSC-H-), cuadrante superior esquerdo (SSC-H+/FSC-H-), cuadrante inferior dereito (SSC-H-/FSC-H+) e cuadrante superior dereito (SSC-H+/FSC-H+) para a análise do tamaño celular e a complexidade citoplasmática. B. A morfoloxía celular analizouse mediante citometría de fluxo empregando FSC-H (dispersión directa, tamaño celular) e SSC-H (dispersión lateral, complexidade citoplasmática) (30 000 eventos). Os datos preséntanse como media ± desviación estándar, n = 3 experimentos independentes. As comparacións estatísticas realizáronse mediante ANOVA unidireccional e proba post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 e ****p < 0,0001
Os metabolitos intestinais como o IPA convertéronse nun tema candente de investigación, o que suxire que se poden descubrir novas dianas na microbiota intestinal. Polo tanto, é interesante que se demostrase que o IPA, un metabolito que relacionamos coa fibrose hepática en humanos [15], é un posible composto antifibrótico en modelos animais [13, 14]. Aquí, demostramos por primeira vez unha asociación entre o IPA sérico e a transcriptómica hepática global e a metilación do ADN en individuos obesos sen diabetes tipo 2 (DM2), destacando a apoptose, a mitofaxia e a lonxevidade, así como un posible xene candidato AKT1 que regula a homeostase hepática. Outra novidade do noso estudo é que demostramos a interacción do tratamento con IPA coa apoptose, a morfoloxía celular, a bioenerxética mitocondrial e a dinámica nas células LX-2, o que indica un espectro de enerxía máis baixo que despraza o fenotipo HSC cara á inactivación, o que converte o IPA nun posible candidato para mellorar a fibrose hepática.
Descubrimos que a apoptose, a mitofaxia e a lonxevidade foron as vías canónicas máis importantes enriquecidas en xenes hepáticos asociados co IPA sérico circulante. A interrupción do sistema de control de calidade mitocondrial (MQC) pode levar á disfunción mitocondrial, mitofaxia e apoptose, promovendo así a aparición de MASLD [33, 34]. Polo tanto, podemos especular que o IPA pode estar implicado no mantemento da dinámica celular e a integridade mitocondrial a través da apoptose, a mitofaxia e a lonxevidade no fígado. Os nosos datos mostraron que dous xenes eran comúns nos tres ensaios: YKT6 e AKT1. Cómpre sinalar que YKT6 é unha proteína SNARE implicada no proceso de fusión da membrana celular. Desempeña un papel na autofaxia e na mitofaxia ao formar un complexo de iniciación con STX17 e SNAP29 no autofagosoma, promovendo así a fusión de autofagosomas e lisosomas [35]. Ademais, a perda da función de YKT6 resulta nun deterioro da mitofaxia[36], mentres que a regulación á alza de YKT6 está asociada coa progresión do carcinoma hepatocelular (HCC), o que mostra un aumento da supervivencia celular[37]. Por outra banda, AKT1 é o xene que interactúa máis importante e desempeña un papel importante nas enfermidades hepáticas, incluíndo a vía de sinalización PI3K/AKT, o ciclo celular, a migración celular, a proliferación, a adhesión focal, a función mitocondrial e a secreción de coláxeno[38–40]. A vía de sinalización PI3K/AKT activada pode activar as células nai hematopoéticas (HSC), que son as células responsables da produción da matriz extracelular (MEC), e a súa desregulación pode contribuír á aparición e progresión da fibrose hepática[40]. Ademais, AKT é un dos factores clave de supervivencia celular que inhibe a apoptose celular dependente de p53, e a activación de AKT pode estar asociada coa inhibición da apoptose das células hepáticas[41, 42]. Os resultados obtidos suxiren que o IPA pode estar implicado na apoptose asociada ás mitocondrias hepáticas ao afectar a decisión dos hepatocitos entre entrar en apoptose ou a supervivencia. Estes efectos poden estar regulados polos xenes candidatos AKT e/ou YKT6, que son fundamentais para a homeostase hepática.
Os nosos resultados mostraron que 1 mM de IPA induciu a apoptose e diminuíu a respiración mitocondrial nas células LX-2 independentemente do tratamento con TGF-β1. É importante salientar que a apoptose é unha vía importante para a resolución da fibrose e a activación das células nai hematopoéticas (HSC), e tamén é un evento clave na resposta fisiolóxica reversible da fibrose hepática [4, 43]. Ademais, a restauración da BHI nas células LX-2 despois do tratamento combinado proporcionou novos coñecementos sobre o papel potencial do IPA na regulación da bioenerxética mitocondrial. En condicións de repouso e inactivas, as células hematopoéticas normalmente utilizan a fosforilación oxidativa mitocondrial para producir ATP e teñen unha baixa actividade metabólica. Por outra banda, a activación das HSC mellora a respiración e a biosíntese mitocondrial para compensar as demandas enerxéticas de entrar no estado glicolítico [44]. O feito de que o IPA non afectase o potencial metabólico e a ECAR suxire que a vía glicolítica está menos priorizada. Do mesmo xeito, outro estudo demostrou que 1 mM de IPA era capaz de modular a actividade da cadea respiratoria mitocondrial en cardiomiocitos, liña celular de hepatocitos humanos (Huh7) e células endoteliais da vea umbilical humana (HUVEC); Non obstante, non se atopou ningún efecto do IPA na glicólise nos cardiomiocitos, o que suxire que o IPA pode afectar a bioenerxética doutros tipos de células [45]. Polo tanto, especulamos que 1 mM de IPA pode actuar como un desacoplador químico suave, xa que pode reducir significativamente a expresión xénica fibroxénica, a morfoloxía celular e a bioenerxética mitocondrial sen cambiar a cantidade de ADNmt [46]. Os desacopladores mitocondriais poden inhibir a fibrose inducida por cultivos e a activación de HSC [47] e reducir a produción mitocondrial de ATP regulada ou inducida por certas proteínas como as proteínas desacopladoras (UCP) ou a translocase de nucleótidos de adenina (ANT). Dependendo do tipo de célula, este fenómeno pode protexer as células da apoptose e/ou promover a apoptose [46]. Non obstante, necesítanse máis estudos para dilucidar o papel do IPA como desacoplador mitocondrial na inactivación das células nai hematopoéticas.
Despois investigamos se os cambios na respiración mitocondrial se reflicten na morfoloxía mitocondrial das células LX-2 vivas. Curiosamente, o tratamento con TGF-β1 altera a proporción mitocondrial de esférica a intermedia, cunha diminución da ramificación mitocondrial e un aumento da expresión de DRP1, un factor clave na fisión mitocondrial [48]. Ademais, a fragmentación mitocondrial está asociada á complexidade xeral da rede, e a transición da fusión á fisión é fundamental para a activación das células nai hematopoéticas (HSC), mentres que a inhibición da fisión mitocondrial leva á apoptose das HSC [49]. Polo tanto, os nosos resultados indican que o tratamento con TGF-β1 pode inducir unha diminución da complexidade da rede mitocondrial cunha diminución da ramificación, que é máis común na fisión mitocondrial asociada ás células nai hematopoéticas (HSC) activadas. Ademais, os nosos datos mostraron que o IPA podería cambiar a proporción de mitocondrias de forma esférica a intermedia, reducindo así a expresión de OPA1 e MFN2. Os estudos demostraron que a regulación á baixa de OPA1 podería causar unha diminución do potencial da membrana mitocondrial e desencadear a apoptose celular [50]. Sábese que MFN2 media a fusión e a apoptose mitocondrial [51]. Os resultados obtidos suxiren que a indución de células LX-2 por TGF-β1 e/ou IPA parece modular a forma e o tamaño das mitocondrias, así como o estado de activación e a complexidade da rede.
Os nosos resultados indican que o tratamento combinado de TGFβ-1 e IPA podería reducir o ADNmt e os parámetros morfolóxicos celulares ao regular a expresión de ARNm de xenes relacionados coa fibrose, a apoptose e a supervivencia en células que evaden a apoptose. De feito, o IPA diminuíu o nivel de expresión de ARNm de AKT1 e de importantes xenes de fibrose como COL1A2 e MMP2, pero aumentou o nivel de expresión de CASP8, que está asociado coa apoptose. Os nosos resultados mostraron que despois do tratamento con IPA, a expresión de BAX diminuíu e a expresión de ARNm das subunidades da familia TIMP1, BCL-2 e NF-κB aumentou, o que suxire que o IPA podería estimular os sinais de supervivencia nas células nai hematopoéticas (HSC) que evaden a apoptose. Estas moléculas poden actuar como sinais prosupervivencia nas células nai hematopoéticas activadas, o que pode estar asociado cun aumento da expresión de proteínas antiapoptóticas (como Bcl-2), unha diminución da expresión de BAX proapoptótica e unha complexa interacción entre TIMP e NF-κB [5, 7]. O IPA exerce os seus efectos a través do PXR, e descubrimos que o tratamento combinado con TGF-β1 e IPA aumentou os niveis de expresión do ARNm do PXR, o que indica a supresión da activación das HSC. Sábese que a sinalización activada do PXR inhibe a activación das HSC tanto in vivo como in vitro [52, 53]. Os nosos resultados indican que o IPA pode participar na eliminación das HSC activadas ao promover a apoptose, reducir a fibrose e o metabolismo mitocondrial e mellorar os sinais de supervivencia, que son procesos típicos que converten o fenotipo das HSC activadas nun inactivado. Outra posible explicación para o posible mecanismo e papel do IPA na apoptose é que elimina as mitocondrias disfuncionais principalmente a través da mitofaxia (vía intrínseca) e a vía de sinalización extrínseca do TNF (Táboa 1), que está directamente ligada á vía de sinalización de supervivencia NF-κB (Figura suplementaria 7). Curiosamente, os xenes enriquecidos relacionados co IPA son capaces de inducir sinais proapoptóticos e prosupervivencia na vía apoptótica [54], o que suxire que o IPA pode inducir a vía apoptótica ou a supervivencia ao interactuar con estes xenes. Non obstante, non se sabe con certeza como o IPA induce a apoptose ou a supervivencia durante a activación das HSC nin as súas vías mecanicistas.
O IPA é un metabolito microbiano formado a partir do triptófano da dieta a través da microbiota intestinal. Os estudos demostraron que ten propiedades antiinflamatorias, antioxidantes e reguladoras epixenéticas no ambiente intestinal.[55] Os estudos demostraron que o IPA pode modular a función da barreira intestinal e reducir o estrés oxidativo, o que pode contribuír aos seus efectos fisiolóxicos locais.[56] De feito, o IPA transpórtase aos órganos diana a través da circulación e, dado que o IPA comparte unha estrutura de metabolitos principais similar co triptófano, a serotonina e os derivados do indol, o IPA exerce accións metabólicas que resultan en destinos metabólicos competitivos.[52] O IPA pode competir cos metabolitos derivados do triptófano por sitios de unión en encimas ou receptores, o que potencialmente interrompe as vías metabólicas normais. Isto destaca a necesidade de máis estudos sobre a súa farmacocinética e farmacodinámica para comprender mellor a súa xanela terapéutica.[57] Queda por ver se isto tamén pode ocorrer nas células nai hematopoéticas (HSC).
Recoñecemos que o noso estudo ten algunhas limitacións. Para examinar especificamente as asociacións relacionadas co IPA, excluímos pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Recoñecemos que isto limita a ampla aplicabilidade dos nosos achados a pacientes con diabetes mellitus tipo 2 e enfermidade hepática avanzada. Aínda que a concentración fisiolóxica de IPA no soro humano é de 1–10 μM [11, 20], elixiuse unha concentración de 1 mM de IPA en función da maior concentración non tóxica [15] e a maior taxa de apoptose, sen diferenza na porcentaxe da poboación de células necróticas. Aínda que se empregaron niveis suprafisiolóxicos de IPA neste estudo, actualmente non hai consenso sobre a dose efectiva de IPA [52]. Aínda que os nosos resultados son significativos, o destino metabólico máis amplo do IPA segue sendo unha área de investigación activa. Ademais, os nosos achados sobre a asociación entre os niveis séricos de IPA e a metilación do ADN dos transcritos hepáticos obtivéronse non só de células nai hematopoéticas (HSC), senón tamén de tecidos hepáticos. Escollemos empregar células LX-2 humanas baseándonos nos nosos achados previos da análise do transcriptoma, que indicaban que o IPA está asociado coa activación das células nai hematopoéticas (HSC) [15], e que as HSC son as principais células implicadas na progresión da fibrose hepática. O fígado está composto por múltiples tipos de células, polo que se deberían considerar outros modelos celulares, como o sistema de cocultivo hepatocito-HSC-célula inmunitaria combinado coa activación de caspases e a fragmentación do ADN, así como o mecanismo de acción, incluído o nivel de proteínas, para estudar o papel do IPA e a súa interacción con outros tipos de células hepáticas.