Diferentes teorías de defensa das plantas proporcionan unha importante orientación teórica para explicar os patróns do metabolismo especializado das plantas, pero as súas predicións clave aínda están por probar. Aquí, empregamos a análise de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) non sesgada para explorar sistematicamente o metaboloma de cepas atenuadas de tabaco desde plantas individuais ata poboacións e especies estreitamente relacionadas, e procesamos un gran número de teorías de características espectrométricas de masas baseadas en espectros compostos na información. Marco para probar as predicións clave das teorías de defensa óptima (DO) e obxectivo móbil (MT). O compoñente de información da metabolómica vexetal é consistente coa teoría DO, pero contradí a principal predición da teoría MT sobre a dinámica metabolómica causada polos herbívoros. Desde a escala evolutiva micro á macro, o sinal de xasmonato identificouse como o principal determinante da DO, mentres que o sinal de etileno proporcionou un axuste fino da resposta específica do herbívoro anotada pola rede molecular MS/MS.
Os metabolitos especiais con estruturas diversas son os principais participantes na adaptación das plantas ao medio ambiente, especialmente na defensa dos inimigos (1). A sorprendente diversificación do metabolismo especial que se atopa nas plantas estimulou décadas de investigación en profundidade sobre os seus moitos aspectos das funcións ecolóxicas e formou unha longa lista de teorías de defensa das plantas, que son o desenvolvemento evolutivo e ecolóxico das interaccións planta-insecto. A investigación empírica proporciona unha orientación importante (2). Non obstante, estas teorías de defensa das plantas non seguiron o camiño normativo do razoamento dedutivo hipotético, no que as predicións clave estaban no mesmo nivel de análise (3) e eran probadas experimentalmente para avanzar no seguinte ciclo de desenvolvemento teórico (4). As limitacións técnicas restrinxen a recollida de datos a categorías metabólicas específicas e exclúen a análise exhaustiva de metabolitos especializados, o que impide as comparacións entre categorías que son esenciais para o desenvolvemento teórico (5). A falta de datos metabolómicos completos e dunha moeda común para comparar o fluxo de traballo de procesamento do espazo metabólico entre diferentes grupos de plantas dificulta a madurez científica do campo.
Os últimos desenvolvementos no campo da metabolómica por espectrometría de masas en tándem (MS/MS) poden caracterizar exhaustivamente os cambios metabólicos dentro e entre as especies dun clado de sistema determinado, e poden combinarse con métodos computacionais para calcular a semellanza estrutural entre estas mesturas complexas. Coñecementos previos de química (5). A combinación de tecnoloxías avanzadas en análise e computación proporciona un marco necesario para as probas a longo prazo de moitas predicións feitas polas teorías ecolóxicas e evolutivas da diversidade metabólica. Shannon (6) introduciu a teoría da información por primeira vez no seu artigo seminal en 1948, sentando as bases para a análise matemática da información, que se utilizou en moitos campos ademais da súa aplicación orixinal. En xenómica, a teoría da información aplicouse con éxito para cuantificar a información conservativa de secuencias (7). Na investigación transcriptómica, a teoría da información analiza os cambios xerais no transcriptoma (8). En investigacións anteriores, aplicamos o marco estatístico da teoría da información á metabolómica para describir a experiencia metabólica a nivel de tecido nas plantas (9). Aquí, combinamos o fluxo de traballo baseado en MS/MS co marco estatístico da teoría da información, caracterizada pola diversidade metabólica na moeda común, para comparar as predicións clave da teoría da defensa das plantas do metaboloma inducido por herbívoros.
Os marcos teóricos da defensa das plantas adoitan ser mutuamente inclusivos e pódense dividir en dúas categorías: aqueles que tentan explicar a distribución de metabolitos específicos das plantas baseándose en funcións de defensa, como a defensa óptima (DO) (10), a teoría do obxectivo móbil (MT) (11) e a teoría da aparencia (12), mentres que outros buscan explicacións mecánicas de como os cambios na dispoñibilidade de recursos afectan o crecemento das plantas e a acumulación de metabolitos especializados, como a hipótese do carbono: balance de nutrientes (13), a hipótese da taxa de crecemento (14) e a hipótese do equilibrio de crecemento e diferenciación (15). Os dous conxuntos de teorías atópanse en diferentes niveis de análise (4). Non obstante, dúas teorías que implican funcións defensivas a nivel funcional dominan a conversa sobre as defensas constitutivas e inducibles das plantas: a teoría DO, que asume que as plantas invisten nas súas custosas defensas químicas só cando é necesario, por exemplo, cando son inxeridas. Cando un animal de herba ataca, polo tanto, segundo a posibilidade dun ataque futuro, asígnaselle o composto cunha función defensiva (10); A hipótese da MT propón que non existe un eixe de cambio direccional dos metabolitos, senón que o metabolito cambia aleatoriamente, creando así a posibilidade de obstruír o "movemento obxectivo" metabólico dos herbívoros atacantes. Noutras palabras, estas dúas teorías fan predicións opostas sobre a remodelación metabólica que se produce despois do ataque dos herbívoros: a relación entre a acumulación unidireccional de metabolitos con función defensiva (DO) e os cambios metabólicos non dirixidos (MT) (11).
As hipóteses de DO e MT inclúen non só os cambios inducidos no metaboloma, senón tamén as consecuencias ecolóxicas e evolutivas da acumulación destes metabolitos, como os custos e beneficios adaptativos destes cambios metabólicos nun ambiente ecolóxico específico (16). Aínda que ambas hipóteses recoñecen a función defensiva de metabolitos especializados, que poden ou non ser caros, a predición clave que distingue as hipóteses de DO e MT reside na direccionalidade dos cambios metabólicos inducidos. A predición da teoría de DO foi a que recibiu a maior atención experimental ata o de agora. Estas probas inclúen o estudo das funcións de defensa directas ou indirectas de diferentes tecidos de compostos específicos en invernadoiros e condicións naturais, así como os cambios na etapa de desenvolvemento das plantas (17-19). Non obstante, ata o de agora, debido á falta dun fluxo de traballo e dun marco estatístico para a análise global integral da diversidade metabólica de calquera organismo, a principal diferenza na predición entre as dúas teorías (é dicir, a dirección dos cambios metabólicos) aínda está por probar. Aquí, proporcionamos dita análise.
Unha das características máis significativas dos metabolitos específicos de plantas é a súa extrema diversidade estrutural a todos os niveis, desde plantas individuais e poboacións ata especies similares (20). Pódense observar moitos cambios cuantitativos nos metabolitos especializados a escala de poboación, mentres que a nivel de especie adoitan manterse fortes diferenzas cualitativas (20). Polo tanto, a diversidade metabólica das plantas é o aspecto principal da diversidade funcional, o que reflicte a adaptabilidade a diferentes nichos, especialmente aqueles nichos con diferentes posibilidades de invasión por insectos especiais e herbívoros comúns (21). Desde o innovador artigo de Fraenkel (22) sobre as razóns da existencia de metabolitos específicos de plantas, as interaccións con varios insectos consideráronse importantes presións de selección, e crese que estas interaccións deron forma ás plantas durante a evolución. Vía metabólica (23). As diferenzas interespecies na diversidade de metabolitos especializados tamén poden reflectir o equilibrio fisiolóxico asociado á defensa constitutiva e inducible das plantas contra as estratexias herbívoras, xa que as dúas especies adoitan estar correlacionadas negativamente entre si (24). Aínda que pode ser beneficioso manter unha boa defensa en todo momento, os cambios metabólicos oportunos asociados coa defensa proporcionan beneficios claros ao permitir que as plantas asignen recursos valiosos a outros investimentos fisiolóxicos (19, 24) e eviten a necesidade de simbiose. Danos colaterais (25). Ademais, estas reorganizacións de metabolitos especializados causadas por insectos herbívoros poden levar a unha distribución destrutiva na poboación (26) e poden reflectir lecturas directas de cambios naturais substanciais no sinal do ácido xasmónico (JA), que pode manterse na poboación. Os sinais JA altos e baixos son compensacións entre a defensa contra os herbívoros e a competencia con especies específicas (27). Ademais, as vías biosintéticas de metabolitos especializados sufrirán unha rápida perda e transformación durante a evolución, o que resultará nunha distribución metabólica irregular entre especies estreitamente relacionadas (28). Estes polimorfismos poden establecerse rapidamente en resposta aos patróns cambiantes dos herbívoros (29), o que significa que a flutuación das comunidades de herbívoros é un factor clave que impulsa a heteroxeneidade metabólica.
Aquí, resolvemos especificamente os seguintes problemas. (I) Como reconfigura o insecto herbívoro o metaboloma da planta? (ii) Cales son os principais compoñentes de información da plasticidade metabólica que se poden cuantificar para probar as predicións da teoría da defensa a longo prazo? (iii) Se se debe reprogramar o metaboloma da planta dun xeito único para o atacante, en caso afirmativo, que papel xoga a hormona vexetal na adaptación dunha resposta metabólica específica e que metabolitos contribúen á especificidade de especie da defensa? (iv) Dado que as predicións feitas por moitas teorías de defensa pódense estender a todos os niveis dos tecidos biolóxicos, preguntámonos como de consistente é a resposta metabólica causada desde a comparación interna ata a comparación interespecies? Con este fin, estudamos sistematicamente o metaboloma foliar da nicotina do tabaco, que é unha planta modelo ecolóxica cun metabolismo rico e especializado, e é eficaz contra as larvas de dous herbívoros nativos, Lepidoptera Datura (Ms) (moi agresiva, principalmente comida). En Solanaceae e Spodoptera littoralis (Sl), os vermes das follas do algodón son unha especie de "xénero", coas plantas hospedadoras de Solanaceae e outros hospedadores doutros xéneros e familias Plant food. Analizamos o espectro metabolómico MS/MS e extraemos descriptores estatísticos da teoría da información para comparar as teorías de OD e MT. Creamos mapas de especificidade para revelar a identidade dos metabolitos clave. A análise ampliouse á poboación nativa de N. nasi e especies de tabaco estreitamente relacionadas para analizar máis a fondo a covarianza entre a sinalización de hormonas vexetais e a indución de OD.
Para capturar un mapa xeral sobre a plasticidade e a estrutura do metaboloma foliar do tabaco herbívoro, empregamos un fluxo de traballo de análise e cálculo desenvolvido previamente para recoller e deconvolucionar de forma exhaustiva espectros MS/MS independentes de datos de alta resolución a partir de extractos de plantas (9). Este método indiferenciado (chamado MS/MS) pode construír espectros de compostos non redundantes, que logo se poden usar para todas as análises a nivel de composto descritas aquí. Estes metabolitos vexetais deconvolucionados son de varios tipos, que constan de centos a miles de metabolitos (uns 500-1000 s/MS/MS aquí). Aquí, consideramos a plasticidade metabólica no marco da teoría da información e cuantificamos a diversidade e o profesionalismo do metaboloma en función da entropía de Shannon da distribución de frecuencia metabólica. Usando a fórmula implementada previamente (8), calculamos un conxunto de indicadores que se poden usar para cuantificar a diversidade do metaboloma (indicador Hj), a especialización do perfil metabólico (indicador δj) e a especificidade metabólica dun só metabolito (indicador Si). Ademais, aplicamos o Índice de Plasticidade por Distancia Relativa (RDPI) para cuantificar a inducibilidade do metaboloma dos herbívoros (Figura 1A) (30). Dentro deste marco estatístico, tratamos o espectro MS/MS como a unidade de información básica e procesamos a abundancia relativa de MS/MS nun mapa de distribución de frecuencias, e despois usamos a entropía de Shannon para estimar a diversidade do metaboloma a partir del. A especialización do metaboloma mídese pola especificidade media dun único espectro MS/MS. Polo tanto, o aumento da abundancia dalgunhas clases de MS/MS despois da indución de herbívoros transfórmase en inducibilidade espectral, RDPI e especialización, é dicir, o aumento do índice δj, porque se producen metabolitos máis especializados e se produce un índice de Si alto. A redución do índice de diversidade Hj reflicte que ou ben se reduce o número de MS/MS xerados ou ben a distribución de frecuencias do perfil cambia nunha dirección menos uniforme, ao tempo que reduce a súa incerteza xeral. Mediante o cálculo do índice Si, é posible destacar que MS/MS son inducidos por certos herbívoros e, pola contra, que MS/MS non responde á indución, o que é un indicador clave para distinguir a predición de MT e OD.
(A) Descriptores estatísticos empregados para a inducibilidade de datos (RDPI), a diversidade (índice Hj), a especialización (índice δj) e a especificidade de metabolitos (índice Si) de herbívoros (H1 a Hx). Un aumento no grao de especialización (δj) indica que, de media, se producirán máis metabolitos específicos de herbívoros, mentres que unha diminución da diversidade (Hj) indica unha diminución na produción de metabolitos ou unha distribución desigual dos metabolitos no mapa de distribución. O valor de Si avalía se o metabolito é específico dunha determinada condición (aquí, herbívoro) ou, pola contra, se mantén ao mesmo nivel. (B) Diagrama conceptual da predición da teoría da defensa usando o eixe da teoría da información. A teoría OD predí que o ataque dos herbívoros aumentará os metabolitos de defensa, aumentando así δj. Ao mesmo tempo, Hj diminúe porque o perfil se reorganiza cara á redución da incerteza da información metabólica. A teoría MT predí que o ataque dos herbívoros causará cambios non direccionais no metaboloma, aumentando así Hj como indicador dun aumento da incerteza da información metabólica e causando unha distribución aleatoria de Si. Tamén propuxemos un modelo mixto, o mellor MT, no que algúns metabolitos con valores defensivos máis altos estarán particularmente incrementados (valor de Si alto), mentres que outros presentan respostas aleatorias (valor de Si máis baixo).
Usando descriptores da teoría da información, interpretamos a teoría OD para predicir que os cambios nos metabolitos especiais inducidos por herbívoros nun estado constitutivo non inducido levarán a (i) un aumento na especificidade metabólica (índice Si) que impulsará a especificidade metabonómica (índice δj). O aumento de) certos grupos especiais de metabolitos con maior valor de defensa, e (ii) a diminución da diversidade do metaboloma (índice Hj) debido ao cambio na distribución da frecuencia metabólica a unha distribución corporal máis abundante en leptina. Ao nivel dun só metabolito, espérase unha distribución ordenada de Si, onde o metabolito aumentará o valor de Si segundo o seu valor de defensa (Figura 1B). Nesta liña, explicamos a teoría MT para predicir que a excitación levará a (i) cambios non direccionais nos metabolitos que resultarán nunha diminución no índice δj, e (ii) un aumento no índice Hj debido a un aumento na incerteza metabólica. Ou aleatoriedade, que pode ser cuantificada pola entropía de Shannon en forma de diversidade xeneralizada. En canto á composición metabólica, a teoría MT predicirá a distribución aleatoria de Si. Tendo en conta que certos metabolitos están baixo condicións específicas baixo condicións específicas e outras condicións non o están baixo condicións específicas, e o seu valor de defensa depende do ambiente, tamén propuxemos un modelo de defensa mixto, no que δj e Hj se distribúen en dous ao longo do Si. Aumentan en todas as direccións, só certos grupos de metabolitos, que teñen valores de defensa máis altos, aumentarán particularmente o Si, mentres que outros terán unha distribución aleatoria (Figura 1B).
Para probar a predición da teoría da defensa redefinida no eixe do descritor da teoría da información, xeramos larvas herbívoras expertas (Ms) ou xeneralistas (Sl) nas follas de Nepenthes pallens (Figura 2A). Mediante a análise de MS/MS, recuperamos 599 espectros de MS/MS non redundantes (ficheiro de datos S1) a partir de extractos de metanol de tecido foliar recollido despois de alimentarse pola eiruga. O uso de índices RDPI, Hj e δj para visualizar a reconfiguración do contido da información nos ficheiros de configuración de MS/MS revela patróns interesantes (Figura 2B). A tendencia xeral é que, como se describe no descritor de información, a medida que as eirugas continúan comendo follas, o grao de toda a reorganización metabólica aumenta co tempo: 72 horas despois de que o herbívoro coma, o RDPI aumenta significativamente. En comparación co control non danado, Hj reduciuse significativamente, o que se debeu ao maior grao de especialización do perfil metabólico, que se cuantificou mediante o índice δj. Esta aparente tendencia é consistente coas predicións da teoría OD, pero é inconsistente coas principais predicións da teoría MT, que cre que os cambios aleatorios (non direccionais) nos niveis de metabolitos se usan como camuflaxe defensiva (Figura 1B). Aínda que o contido de elicitores da secreción oral (OS) e o comportamento alimentario destes dous herbívoros son diferentes, a súa alimentación directa provocou cambios similares nas direccións de Hj e δj durante os períodos de colleita de 24 e 72 horas. A única diferenza produciuse ás 72 horas de RDPI. En comparación co causado pola alimentación con Ms, o metabolismo xeral inducido pola alimentación con Sl foi maior.
(A) Deseño experimental: os herbívoros de porco común (S1) ou expertos (Ms) aliméntanse con follas desalinizadas de plantas de carnicero, mentres que para a herbivoría simulada, úsase a OS de Ms (W + OSMs) para manexar a punción da ferida nas posicións estandarizadas das follas. S1 (W + OSSl) larvas ou auga (W + W). O control (C) é unha folla non danada. (B) Índice de inducibilidade (RDPI comparado co gráfico de control), diversidade (índice Hj) e especialización (índice δj) calculados para o mapa de metabolitos especiais (599 MS/MS; ficheiro de datos S1). Os asteriscos indican diferenzas significativas entre a alimentación directa con herbívoros e o grupo de control (proba t de Student coa proba t emparellada, *P<0,05 e ***P<0,001). ns, non importante. (C) Índice de resolución temporal do espectro de metabolitos principal (caixa azul, aminoácido, ácido orgánico e azucre; ficheiro de datos S2) e especial (caixa vermella 443 MS/MS; ficheiro de datos S1) despois dun tratamento de herbivorismo simulado. A banda de cor refírese ao intervalo de confianza do 95 %. O asterisco indica a diferenza significativa entre o tratamento e o control [análise cuadrática da varianza (ANOVA), seguida da diferenza honestamente significativa de Tukey (HSD) para comparacións múltiples post hoc, *P<0,05, **P<0,01 e *** P<0,001]. (D) Especialización de diagramas de dispersión e perfís especiais de metabolitos (mostras repetidas con diferentes tratamentos).
Para explorar se a remodelación inducida polos herbívoros a nivel do metaboloma se reflicte nos cambios no nivel de metabolitos individuais, primeiro centrámonos nos metabolitos estudados previamente nas follas de *Nepenthes pallens* con resistencia probada aos herbívoros. As amidas fenólicas son conxugados de hidroxicinamamida-poliamina que se acumulan durante o proceso de herbivoría dos insectos e sábese que reducen o rendemento dos insectos (32). Buscamos os precursores do MS/MS correspondente e representamos as súas curvas cinéticas acumulativas (Figura S1). Como era de esperar, os derivados do fenol que non están directamente implicados na defensa contra os herbívoros, como o ácido cloroxénico (CGA) e a rutina, están regulados á baixa despois da herbivoría. Pola contra, os herbívoros poden facer que as amidas de fenol sexan moi potentes. A alimentación continua dos dous herbívoros deu lugar a case o mesmo espectro de excitación das fenamidas, e este patrón foi especialmente obvio para a síntese de novo de fenamidas. O mesmo fenómeno observarase ao explorar a vía dos glicósidos de diterpeno 17-hidroxixeranil nonanodiol (17-HGL-DTG), que produce un gran número de diterpenos acíclicos con funcións antiherbívoras eficaces (33), dos cales a alimentación con Ms con Sl desencadeou un perfil de expresión similar (Figura S1)).
A posible desvantaxe dos experimentos de alimentación directa con herbívoros é a diferenza na taxa de consumo de follas e o tempo de alimentación dos herbívoros, o que dificulta a eliminación dos efectos específicos do herbívoro causados ​​por feridas e herbívoros. Para resolver mellor a especificidade das especies de herbívoro na resposta metabólica inducida polas follas, simulamos a alimentación das larvas de Ms e Sl aplicando inmediatamente o OS recén recollido (OSM e OSS1) á punción estándar W de posicións foliares consistentes. Este procedemento chámase tratamento W + OS e estandariza a indución ao cronometrar con precisión o inicio da resposta provocada polo herbívoro sen causar efectos de confusión por diferenzas na taxa ou cantidade de perda de tecido (Figura 2A) (34). Usando a canle de análise e cálculo de MS/MS, recuperamos 443 espectros de MS/MS (ficheiro de datos S1), que se solapaban cos espectros previamente reunidos a partir de experimentos de alimentación directa. A análise da teoría da información deste conxunto de datos de MS/MS mostrou que a reprogramación de metabolomas especializados en follas mediante a simulación de herbívoros mostrou induccións específicas de OS (Figura 2C). En particular, en comparación co tratamento con OSS1, o OSM causou unha mellora da especialización do metaboloma ás 4 horas. Cómpre sinalar que, en comparación co conxunto de datos experimentais de alimentación directa con herbívoros, a cinética metabólica visualizada no espazo bidimensional usando Hj e δj como coordenadas e a direccionalidade da especialización do metaboloma en resposta ao tratamento con herbívoros simulados ao longo do tempo aumentou de forma consistente (Figura 2D). Ao mesmo tempo, cuantificamos o contido de aminoácidos, ácidos orgánicos e azucres (ficheiro de datos S2) para investigar se este aumento específico na experiencia do metaboloma se debe á reconfiguración do metabolismo central do carbono en resposta a herbívoros simulados (Figura S2). Para explicar mellor este patrón, monitorizamos aínda máis a cinética de acumulación metabólica das vías de fenolamida e 17-HGL-DTG mencionadas anteriormente. A indución específica de OS de herbívoros transfórmase nun patrón de rearranxo diferencial dentro do metabolismo da fenolamida (Figura S3). As amidas fenólicas que conteñen restos de cumarina e cafeoílo son inducidas preferentemente por OSS1, mentres que as OSM desencadean unha indución específica de conxugados de ferulilo. Para a vía 17-HGL-DTG, detectouse unha indución diferencial de OS por produtos de malolinización e dimalonilación posteriores (Figura S3).
A continuación, estudamos a plasticidade do transcriptoma inducida por OS empregando o conxunto de datos de microarrays de curso temporal, que simula o uso de OSM para tratar as follas das plantas de roseta en herbívoros. A cinética de mostraxe basicamente solapase coa cinética empregada neste estudo metabolómico (35). En comparación coa reconfiguración do metaboloma na que a plasticidade metabólica aumenta particularmente co tempo, observamos explosións de transcrición transitorias nas follas inducidas por Ms, onde a inducibilidade do transcriptoma (RDPI) e a especialización (δj) están en 1. Houbo un aumento significativo nas horas e na diversidade (Hj) neste punto temporal, a expresión de BMP1 reduciuse significativamente, seguida da relaxación da especialización do transcriptoma (Figura S4). As familias de xenes metabólicos (como P450, glicosiltransferase e BAHD aciltransferase) participan no proceso de ensamblaxe de metabolitos especiais a partir de unidades estruturais derivadas do metabolismo primario, seguindo o modelo de alta especialización temperá mencionado anteriormente. Como estudo de caso, analizouse a vía da fenilalanina. A análise confirmou que os xenes principais no metabolismo da fenolamida están altamente inducidos pola OS en herbívoros en comparación coas plantas non atraídas, e están estreitamente aliñados nos seus patróns de expresión. O factor de transcrición MYB8 e os xenes estruturais PAL1, PAL2, C4H e 4CL augas arriba desta vía mostraron un inicio temperán da transcrición. As aciltransferases que desempeñan un papel na ensamblaxe final da fenolamida, como AT1, DH29 e CV86, presentan un patrón de regulación á alza prolongado (Figura S4). As observacións anteriores indican que o inicio temperán da especialización do transcriptoma e a posterior mellora da especialización metabolómica son un modo acoplado, o que pode deberse ao sistema regulador síncrono que inicia unha poderosa resposta de defensa.
A reconfiguración na sinalización das hormonas vexetais actúa como unha capa reguladora que integra a información herbívora para reprogramar a fisioloxía das plantas. Despois da simulación de herbívoros, medimos a dinámica acumulativa das categorías clave de hormonas vexetais e visualizamos a coexpresión temporal entre elas [coeficiente de correlación de Pearson (PCC) > 0,4] (Figura 3A). Como era de esperar, as hormonas vexetais relacionadas coa biosíntese están ligadas dentro da rede de coexpresión de hormonas vexetais. Ademais, a especificidade metabólica (índice Si) mapeouse a esta rede para destacar as hormonas vexetais inducidas por diferentes tratamentos. Debúxanse dúas áreas principais de resposta específica herbívora: unha está no clúster JA, onde JA (a súa forma bioloxicamente activa JA-Ile) e outros derivados de JA mostran a puntuación de Si máis alta; a outra é o etileno (ET). A xiberelina mostrou só un aumento moderado na especificidade herbívora, mentres que outras hormonas vexetais, como a citocinina, a auxina e o ácido abscísico, tiveron unha baixa especificidade de indución para os herbívoros. En comparación co uso só de W + W, a amplificación do valor máximo dos derivados de JA a través da aplicación de OS (W + OS) pódese transformar basicamente nun forte indicador específico de JA. Inesperadamente, sábese que OSM e OSS1 con diferente contido de elicitores causan unha acumulación similar de JA e JA-Ile. En contraste con OSS1, OSM é inducido de forma específica e fortemente polos OSM, mentres que OSS1 non amplifica a resposta das feridas basais (Figura 3B).
(A) Análise de rede de coexpresión baseada no cálculo PCC da simulación da cinética de acumulación de hormonas vexetais inducida por herbívoros. O nodo representa unha única hormona vexetal e o tamaño do nodo representa o índice de Si específico da hormona vexetal entre os tratamentos. (B) Acumulación de JA, JA-Ile e ET en follas causada por diferentes tratamentos indicada por diferentes cores: albaricoque, W + OSM; azul, W + OSSl; negro, W + W; gris, C (control). Os asteriscos indican diferenzas significativas entre o tratamento e o control (ANOVA bidireccional seguida de comparación múltiple post hoc de Tukey HSD, *** P <0,001). Análise da teoría da información de (C)697 MS/MS (ficheiro de datos S1) na biosíntese de JA e espectro de percepción alterado (irAOC e irCOI1) e (D)585 MS/MS (ficheiro de datos S1) en ETR1 con sinal ET alterado. Dous tratamentos con herbívoros simulados activaron liñas de plantas e plantas de control con vehículo baleiro (EV). Os asteriscos indican diferenzas significativas entre o tratamento W+OS e o control sen danos (ANOVA bidireccional seguida de comparación múltiple post hoc de Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). (E) Gráficos dispersos da oposición dispersa á especialización. As cores representan diferentes cepas modificadas xeneticamente; os símbolos representan diferentes métodos de tratamento: triángulo, W + OSS1; rectángulo, W + OSM; círculo C
A continuación, empregamos unha cepa modificada xeneticamente de Nepenthes atenuada (irCOI1 e sETR1) nos pasos clave da biosíntese de JA e ET (irAOC e irACO) e da percepción (irCOI1 e sETR1) para analizar o metabolismo destas dúas hormonas vexetais en herbívoros. A contribución relativa da reprogramación. De acordo con experimentos previos, confirmamos a indución de OS herbívoro en plantas portadoras baleiras (EV) (Figura 3, C a D) e a diminución xeral do índice Hj causada por OSM, mentres que o índice δj aumentaba. A resposta é máis pronunciada que a resposta desencadeada por OSS1. Un gráfico de dúas liñas que usa Hj e δj como coordenadas mostra a desregulación específica (Figura 3E). A tendencia máis obvia é que, nas cepas que carecen de sinal de JA, os cambios en diversidade e especialización do metaboloma causados ​​polos herbívoros elimínanse case por completo (Figura 3C). En contraste, a percepción silenciosa de ET nas plantas sETR1, aínda que o efecto xeral sobre os cambios no metabolismo herbívoro é moito menor que o da sinalización JA, atenúa a diferenza nos índices Hj e δj entre as excitacións OSM e OSS1 (Figura 3D e Figura S5). Isto indica que, ademais da función principal da transdución de sinal JA, a transdución de sinal ET tamén serve como axuste fino da resposta metabólica específica da especie dos herbívoros. En consonancia con esta función de axuste fino, non houbo ningún cambio na inducibilidade xeral do metaboloma nas plantas sETR1. Por outra banda, en comparación coas plantas sETR1, as plantas irACO induciron amplitudes xerais similares de cambios metabólicos causados ​​polos herbívoros, pero mostraron puntuacións Hj e δj significativamente diferentes entre os desafíos OSM e OSS1 (Figura S5).
Para identificar metabolitos especializados que teñan contribucións importantes á resposta específica da especie dos herbívoros e axustar a súa produción a través de sinais ET, empregamos o método MS/MS estrutural desenvolvido previamente. Este método baséase no método de biclústering para reinferir a familia metabólica a partir de fragmentos MS/MS [produto escalar normalizado (NDP)] e a puntuación de semellanza baseada na perda neutra (NL). O conxunto de datos MS/MS construído mediante a análise de liñas transxénicas ET produciu 585 MS/MS (ficheiro de datos S1), que se resolveu agrupándoos en sete módulos MS/MS principais (M) (Figura 4A). Algúns destes módulos están densamente empaquetados con metabolitos especiais previamente caracterizados: por exemplo, M1, M2, M3, M4 e M7 son ricos en varios derivados do fenol (M1), glicósidos flavonoides (M2), azucres acílicos (M3 e M4) e 17-HGL-DTG (M7). Ademais, calcúlase a información metabólica específica (índice de Si) dun só metabolito en cada módulo e a súa distribución de Si pódese ver intuitivamente. En resumo, os espectros MS/MS que mostran unha alta especificidade de herbivoría e xenotipo caracterízanse por altos valores de Si, e as estatísticas de curtose indican a distribución do pelo na esquina dereita da cola. Detectouse unha destas distribucións coloidais magras en M1, na que a fenolamida mostrou a maior fracción de Si (Figura 4B). O 17-HGL-DTG inducible por herbívoros mencionado anteriormente en M7 mostrou unha puntuación de Si moderada, o que indica un grao moderado de regulación diferencial entre os dous tipos de SO. En contraste, a maioría dos metabolitos especializados producidos constitutivamente, como a rutina, o CGA e os azucres acílicos, están entre as puntuacións de Si máis baixas. Para explorar mellor a complexidade estrutural e a distribución de Si entre metabolitos especiais, construíuse unha rede molecular para cada módulo (Figura 4B). Unha predición importante da teoría da DO (resumida na Figura 1B) é que a reorganización de metabolitos especiais despois da herbivoría debería levar a cambios unidireccionais nos metabolitos con alto valor de defensa, especialmente ao aumentar a súa especificidade (en oposición á distribución aleatoria) Modo) Metabolito defensivo predicido pola teoría MT. A maioría dos derivados do fenol acumulados en M1 están funcionalmente relacionados co declive do rendemento dos insectos (32). Ao comparar os valores de Si nos metabolitos M1 entre as follas inducidas e as follas constituíntes das plantas de control EV ás 24 horas, observamos que a especificidade metabólica de moitos metabolitos despois dos insectos herbívoros ten unha tendencia crecente significativa (Figura 4C). O aumento específico no valor de Si detectouse só en fenamidas defensivas, pero non se detectou ningún aumento no valor de Si noutros fenois e metabolitos descoñecidos que coexisten neste módulo. Este é un modelo especializado, que está relacionado coa teoría da DO. As principais predicións de cambios metabólicos causados ​​polos herbívoros son consistentes. Para comprobar se esta particularidade do espectro de fenolamida era inducida por ET específica de OS, representamos graficamente o índice de Si do metabolito e provocamos un valor de expresión diferencial entre OSM e OSS1 nos xenotipos EV e sETR1 (Figura 4D). En sETR1, a diferenza inducida por fenamida entre OSM e OSS1 reduciuse considerablemente. O método de biclústering tamén se aplicou aos datos de MS/MS recollidos en cepas con JA insuficiente para inferir os principais módulos de MS/MS relacionados coa especialización metabólica regulada por JA (Figura S6).
(A) Os resultados de agrupamento en clústeres de 585 MS/MS baseados no fragmento compartido (semellanza NDP) e na perda neutra compartida (semellanza NL) dan como resultado que o módulo (M) sexa consistente coa familia de compostos coñecida, ou por composición de metabolitos descoñecida ou mal metabolizada. Xunto a cada módulo, móstrase a distribución específica do metabolito (MS/MS) (Si). (B) Rede molecular modular: os nodos representan MS/MS e bordos, puntuacións MS/MS NDP (vermello) e NL (azul) (límite de corte, > 0,6). O índice de especificidade do metabolito graduado (Si) coloreado segundo o módulo (esquerda) e mapeado á rede molecular (dereita). (C) Módulo M1 da planta EV en estado constitutivo (control) e inducido (herbívoro simulado) ás 24 horas: diagrama da rede molecular (o valor de Si é o tamaño do nodo, a fenolamida defensiva está resaltada en azul). (D) Diagrama da rede molecular M1 da liña espectral sETR1 con percepción alterada de EV e ET: o composto fenólico representado polo nodo do círculo verde e a diferenza significativa (valor P) entre os tratamentos W + OSM e W + OSS1 como tamaño do nodo. CP, N-cafeoil-tirosina; CS, N-cafeoil-espermidina; FP, ácido éster úrico do ácido N-ferúlico; FS, N-ferulil-espermidina; CoP, N', N “-cumarolil-tirosina; DCS, N', N”-dicafeoil-espermidina; CFS, N', N”-cafeoil, feruloil-espermidina; Lycium barbarum en goji Son; Nick. O-AS, azucre O-acílico.
Ampliamos aínda máis a análise dun único xenotipo atenuado de Nepenthes a poboacións naturais, onde xa se describiran previamente fortes cambios intraespecíficos nos niveis de JA herbívoros e nos niveis de metabolitos específicos en poboacións naturais (26). Empregamos este conxunto de datos para abarcar 43 xermoplasmas. Estes xermoplasmas constan de 123 especies de plantas de N. pallens. Estas plantas foron tomadas de sementes recollidas en diferentes hábitats nativos en Utah, Nevada, Arizona e California (Figura S7), calculamos a diversidade do metaboloma (aquí chamada nivel de poboación) β diversidade) e a especialización causada por OSM. En consonancia con estudos previos, observamos unha ampla gama de cambios metabólicos ao longo dos eixes Hj e δj, o que indica que os xermoplasmas teñen diferenzas significativas na plasticidade das súas respostas metabólicas aos herbívoros (Figura S7). Esta organización lembra as observacións previas sobre o rango dinámico dos cambios de JA causados ​​polos herbívoros e mantivo un valor moi alto nunha soa poboación (26, 36). Ao usar JA e JA-Ile para probar a correlación de nivel global entre Hj e δj, atopamos que existe unha correlación positiva significativa entre JA e o índice de diversidade e especialización do metaboloma β (Figura S7). Isto suxire que a heteroxeneidade inducida por herbívoros na indución de JA detectada a nivel de poboación pode deberse a polimorfismos metabólicos clave causados ​​pola selección de insectos herbívoros.
Estudos previos demostraron que os tipos de tabaco difiren moito en canto ao tipo e á dependencia relativa das defensas metabólicas inducidas e constitutivas. Crese que estes cambios na transdución de sinais e nas capacidades de defensa antiherbívoras están regulados pola presión da poboación de insectos, o ciclo de vida da planta e os custos de produción de defensa no nicho onde crece unha especie determinada. Estudamos a consistencia da remodelación do metaboloma das follas inducida por herbívoros de seis especies de Nicotiana nativas de América do Norte e América do Sur. Estas especies están estreitamente relacionadas con Nepenthes de América do Norte, concretamente Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. herba atenuada, Nicotiana tabacum, tabaco lineal, tabaco (Nicotiana spegazzinii) e tabaco de folla de tabaco (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Seis destas especies, incluída a especie ben caracterizada N. please, son plantas anuais do clado petunia, e N. obtusifolia son plantas perennes do clado irmán Trigonophyllae (38). Posteriormente, realizouse a indución de W + W, W + OSM e W + OSS1 nestas sete especies para estudar o rearranxo metabólico da alimentación dos insectos a nivel de especie.
(A) Unha árbore filoxenética bootstrap baseada na máxima verosimilitude [para a síntese de glutamina nuclear (38)] e a distribución xeográfica de sete especies de Nicotiana estreitamente relacionadas (diferentes cores) (37). (B) Un diagrama de dispersión da diversidade especializada para os perfís metabólicos de sete especies de Nicotiana (939 MS/MS; ficheiro de datos S1). A nivel de especie, a diversidade do metaboloma está correlacionada negativamente co grao de especialización. A análise da correlación a nivel de especie entre a diversidade metabólica e a especialización e a acumulación de JA móstrase na Figura 2. S9. Cor, diferentes tipos; triángulo, W + OSS1; rectángulo, W + OSM; (C) A dinámica de JA e JA-Ile de Nicotiana clasifícase segundo a amplitude de excitación de OS (ANOVA bidireccional e comparación posmúltiple de Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 e * ** Para a comparación de W + OS e W + W, P <0,001). Diagrama de caixa da diversidade (D) e a especialización (E) de cada especie despois de simular JA herbívoro e metil (MeJA). O asterisco indica a diferenza significativa entre W + OS e W + W ou lanolina máis W (Lan + W) ou Lan máis MeJA (Lan + MeJa) e o control Lan (análise da varianza bidireccional, seguida de comparación múltiple post hoc de Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001).
Usando o método de clúster dual, identificamos 9 módulos de 939 MS/MS (ficheiro de datos S1). A composición de MS/MS reconfigurada por diferentes tratamentos varía moito entre os diferentes módulos entre especies (Figura S8). A visualización de Hj (denominada aquí diversidade γ a nivel de especie) e δj revela que as diferentes especies agréganse en grupos moi diferentes no espazo metabólico, onde a división a nivel de especie adoita ser máis prominente que a excitación. Coa excepción de N. linear e N. obliquus, presentan unha ampla gama dinámica de efectos de indución (Figura 5B). En contraste, especies como N. purpurea e N. obtusifolia teñen unha resposta metabólica menos obvia ao tratamento, pero o metaboloma é máis diverso. A distribución específica da especie da resposta metabólica inducida deu lugar a unha correlación negativa significativa entre a especialización e a diversidade gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Os cambios inducidos pola OS nos niveis de JAs están correlacionados positivamente coa especialización do metaboloma e correlacionados negativamente coa diversidade gamma metabólica exhibida por cada especie (Figura 5B e Figura S9). Cómpre sinalar que as especies ás que se fai referencia coloquialmente como especies de "resposta ao sinal" na Figura 5C, como Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute e Nepenthes attenuated, causaron signos significativos aos 30 minutos. Os recentes brotes de JA e JA-Ile específicos de OS, mentres que outras bacterias denominadas "non sensibles ao sinal", como Nepenthes mills, Nepenthes powdery e N. obtusifolia, só mostran indución de JA-Ile Edge sen ningunha especificidade de OS (Figura 5C). A nivel metabólico, como se mencionou anteriormente, para Nepenthes atenuada, as substancias sensibles ao sinal mostraron especificidade de OS e aumentaron significativamente δj, mentres que reduciron Hj. Este efecto de cebado específico de OS non se detectou en especies clasificadas como especies non reactivas ao sinal (Figura 5, D e E). Os metabolitos específicos do OS compártense con máis frecuencia entre as especies que responden ao sinal, e estes grupos de sinais agrúpanse con especies con respostas de sinal máis débiles, mentres que as especies con respostas de sinal máis débiles mostran menos interdependencia (Figura S8). Este resultado indica que a indución de JAs específica do OS e a reconfiguración específica do OS do metaboloma augas abaixo están acopladas a nivel de especie.
A continuación, empregamos unha pasta de lanolina que contén metil xarope de acetato (MeJA) para tratar plantas e investigar se estes modos de acoplamento están restrinxidos pola dispoñibilidade de xarope de acetato aplicado por xarope de acetato exóxeno, que estará no citoplasma das plantas. A desesterificación rápida é o xarope de acetato. Atopamos a mesma tendencia de cambio gradual de especies sensibles ao sinal a especies non sensibles ao sinal causada polo subministro continuo de xarope de acetato (Figura 5, D e E). En resumo, o tratamento con MeJA reprogramou fortemente os metabolomas dos nematodos lineares, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens e N. mikimotoi, o que resultou nun aumento significativo en δj e unha diminución en Hj. N. purpurea só mostrou un aumento en δj, pero non en Hj. N. obtusifolia, que anteriormente se demostrou que acumula niveis extremadamente baixos de xaropes de acetato, tamén responde mal ao tratamento con MeJA en termos de reconfiguración do metaboloma. Estes resultados indican que a produción de xarope de acetato ou a transdución de sinais está fisioloxicamente restrinxida en especies que non responden ao sinal. Para probar esta hipótese, estudamos as catro especies (N. pallens, N. mills, N. pink e N. microphylla) inducidas polo transcriptoma W + W, W + OSM e W + OSS1 (39). De acordo co patrón de remodelación do metaboloma, as especies están ben separadas no espazo do transcriptoma, entre as cales N. attenuated mostrou o RDPI inducido por OS máis alto, mentres que N. gracilis tivo o máis baixo (Figura 6A). Non obstante, descubriuse que a diversidade do transcriptoma inducida por N. oblonga foi a máis baixa entre as catro especies, ao contrario da maior diversidade metabonómica de N. oblonga mostrada anteriormente en sete especies. Estudos previos demostraron que un conxunto de xenes relacionados cos sinais de defensa temperá, incluídos os sinais JA, explica a especificidade das respostas de defensa temperá inducidas por elicitores relacionados cos herbívoros nas especies de Nicotiana (39). A comparación das vías de sinalización JA entre estas catro especies revelou un patrón interesante (Figura 6B). A maioría dos xenes desta vía, como AOC, OPR3, ACX e COI1, mostraron niveis de indución relativamente altos nestas catro especies. Non obstante, un xene clave, JAR4, converte o JA na súa forma bioloxicamente activa de transcritos acumulados de JA-Ile, e o seu nivel de transcrición é moi baixo, especialmente en N. mills, Nepenthes pieris e N. microphylla. Ademais, só o transcrito doutro xene, AOS, non se detectou en N. bifidum. Estes cambios na expresión xénica poden ser responsables dos fenotipos extremos inducidos pola baixa produción de JA en especies anérxicas de sinalización e a indución de N. gracilis.
(A) Análise da teoría da información da reprogramación das respostas transcricionais temperás de catro especies de tabaco estreitamente relacionadas, mostradas 30 minutos despois da indución herbivora. O RDPI calcúlase comparando as follas inducidas pola OS herbívora co control da ferida. As cores indican diferentes especies e os símbolos indican diferentes métodos de tratamento. (B) Análise da expresión xénica nas vías de sinalización JA entre catro especies. A ruta JA simplificada móstrase xunto ao diagrama de caixa. As diferentes cores indican diferentes métodos de procesamento. O asterisco indica que hai unha diferenza significativa entre o tratamento W + OS e o control W + W (para a proba t de Student para diferenzas por pares, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). OPDA, ácido 12-oxofitodienoico; OPC-8: ácido 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenil)-ciclopentano-1-octanoico.
Na última parte, estudamos como a remodelación específica das especies de insectos do metaboloma de diferentes especies de plantas pode ser resistente aos herbívoros. Investigacións previas fixeron fincapé no xénero Nicotiana. A súa resistencia a Ms e larvas difire moito (40). Aquí, estudamos a conexión entre este modelo e a súa plasticidade metabólica. Usando as catro especies de tabaco mencionadas anteriormente e probando a correlación entre a diversidade e a especialización do metaboloma causada polos herbívoros e a resistencia das plantas a Ms e Sl, atopamos que a resistencia, a diversidade e a especialización ao Sl xeneralista están correlacionadas positivamente, mentres que a correlación entre a resistencia ás damas expertas e a especialización é débil, e a correlación coa diversidade non é significativa (Figura S10). Con respecto á resistencia S1, tanto o N. chinensis atenuado como o N. gracilis, que previamente se demostrara que exhibían tanto niveis de transdución de sinais JA como plasticidade do metaboloma, tiveron respostas moi diferentes á indución de herbívoros e tamén mostraron unha resistencia similarmente alta. Sexo.
Nos últimos sesenta anos, a teoría da defensa das plantas proporcionou un marco teórico, baseado no cal os investigadores predixeron un número considerable de evolución e funcións dos metabolitos especializados das plantas. A maioría destas teorías non seguen o procedemento normal de inferencias fortes (41). Propoñen predicións clave (3) ao mesmo nivel de análise. Cando a proba das predicións clave permite analizar teorías específicas, isto fará que o campo estea a avanzar. Será apoiado, pero rexeitará outras (42). En cambio, a nova teoría fai predicións a diferentes niveis de análise e engade unha nova capa de consideracións descritivas (42). Non obstante, as dúas teorías propostas a nivel funcional, MT e OD, pódense explicar facilmente como predicións importantes de cambios metabólicos especializados causados ​​por herbívoros: a teoría OD cre que os cambios no "espazo" metabólico especializado son altamente direccionais. A teoría MT cre que estes cambios serán non direccionais e estarán situados aleatoriamente no espazo metabólico, e tenden a ter metabolitos de alto valor de defensa. Os exames previos das predicións de OD e MT foron probados utilizando un conxunto estreito de compostos de "defensa" a priori. Estas probas centradas nos metabolitos impiden a capacidade de analizar o alcance e a traxectoria da reconfiguración do metaboloma durante a herbivoría e non permiten que as probas dentro dun marco estatístico consistente requiran predicións clave que se poidan considerar como un todo. Cuantificar os cambios no metaboloma das plantas. Aquí, empregamos a tecnoloxía innovadora en metabolómica baseada na MS computacional e realizamos unha análise de MS de deconvolución na vixencia xeral dos descriptores da teoría da información para probar a distinción entre os dous propostos a nivel metabolómico global. A predición clave desta teoría. A teoría da información aplicouse en moitos campos, especialmente no contexto da investigación sobre a biodiversidade e o fluxo de nutrientes (43). Non obstante, polo que sabemos, esta é a primeira aplicación utilizada para describir o espazo de información metabólica das plantas e resolver problemas ecolóxicos relacionados cos cambios metabólicos temporais en resposta a sinais ambientais. En particular, a capacidade deste método reside na súa capacidade para comparar patróns dentro e entre especies de plantas para examinar como os herbívoros evolucionaron de diferentes especies a patróns macroevolutivos interespecies en diferentes niveis de evolución. Metabolismo.
A análise de compoñentes principais (ACP) converte un conxunto de datos multivariantes nun espazo de redución de dimensionalidade para que se poida explicar a tendencia principal dos datos, polo que se usa normalmente como unha técnica exploratoria para analizar o conxunto de datos, como o metaboloma de deconvolución. Non obstante, a redución da dimensionalidade perderá parte do contido de información no conxunto de datos, e a ACP non pode proporcionar información cuantitativa sobre características que son particularmente relevantes para a teoría ecolóxica, como: como os herbívoros reconfiguran a diversidade en campos especializados (por exemplo, riqueza, distribución e abundancia) metabolitos? Que metabolitos son preditores do estado inducido dun determinado herbívoro? Desde a perspectiva da especificidade, a diversidade e a inducibilidade, o contido de información do perfil de metabolitos específico da folla descomponse e chégase á conclusión de que a alimentación dos herbívoros pode activar un metabolismo específico. Inesperadamente, observamos que, como se describe nos indicadores da teoría da información implementados, a situación metabólica resultante ten unha gran superposición despois dos ataques dos dous herbívoros (o xeneralista alimentado pola noite Sl) e a experta en Solanaceae Ms. Aínda que o seu comportamento alimentario e concentración son significativamente diferentes. Iniciador do conxugado de ácidos graxos e aminoácidos (FAC) en OS (31). Ao usar OS herbívoro para tratar feridas punzantes estandarizadas, o tratamento simulado con herbívoros tamén mostrou unha tendencia similar. Este procedemento estandarizado para simular a resposta das plantas aos ataques de herbívoros elimina os factores de confusión causados ​​polos cambios no comportamento alimentario dos herbívoros, que levan a diferentes graos de dano en diferentes momentos (34). O FAC, que se sabe que é a principal causa da OSM, reduce as respostas do JAS e outras hormonas vexetais en OSS1, mentres que a OSS1 se reduce centos de veces (31). Non obstante, a OSS1 causou niveis similares de acumulación de JA en comparación coa OSM. Demostrouse previamente que a resposta de JA en Nepenthes atenuada é moi sensible á OSM, onde o FAC pode manter a súa actividade mesmo se se dilue 1:1000 con auga (44). Polo tanto, en comparación coa OSM, aínda que o FAC en OSS1 é moi baixo, é suficiente para inducir un brote de JA suficiente. Estudos previos demostraron que as proteínas de tipo porina (45) e os oligosacáridos (46) poden empregarse como pistas moleculares para desencadear respostas de defensa das plantas en OSS1. Non obstante, aínda non está claro se estes elicitores en OSS1 son responsables da acumulación de JA observada no presente estudo.
Aínda que existen poucos estudos que describan as pegadas dixitais metabólicas diferenciais causadas pola aplicación de diferentes herbívoros ou JA ou SA (ácido salicílico) exóxenos (47), ninguén perturbou a perturbación específica da especie de herbívoro na rede de herbas vexetais e os seus efectos sobre a información persoal específica. O impacto xeral do metabolismo estúdase sistematicamente. Esta análise confirmou ademais que a conexión da rede hormonal interna con outras hormonas vexetais distintas dos JA configura a especificidade da reorganización metabólica causada polos herbívoros. En particular, detectamos que a ET causada por OSM era significativamente maior que a causada por OSS1. Este modo é consistente cun maior contido de FAC en OSM, o que é unha condición necesaria e suficiente para desencadear unha explosión de ET (48). No contexto da interacción entre plantas e herbívoros, a función de sinalización da ET na dinámica de metabolitos específicos da planta segue sendo esporádica e só se dirixe a un único grupo de compostos. Ademais, a maioría dos estudos utilizaron a aplicación exóxena de ET ou os seus precursores ou varios inhibidores para estudar a regulación da ET, entre os cales estas aplicacións químicas exóxenas producirán moitos efectos secundarios non específicos. Ata onde sabemos, este estudo representa o primeiro exame sistemático a grande escala do papel da ET no uso da ET para producir e percibir plantas transxénicas con alteracións para coordinar a dinámica do metaboloma das plantas. A indución de ET específica de herbívoros pode modular en última instancia a resposta do metaboloma. O máis significativo é a manipulación transxénica dos xenes de biosíntese de ET (ACO) e percepción (ETR1) que revelou a acumulación de novo de fenamidas específica de herbívoros. Anteriormente demostrouse que a ET pode axustar a acumulación de nicotina inducida por JA regulando a putrescina N-metiltransferase (49). Non obstante, desde un punto de vista mecánico, non está claro como a ET axusta a indución de fenamida. Ademais da función de transdución de sinais da ET, o fluxo metabólico tamén se pode derivar a S-adenosil-1-metionina para regular o investimento en amidas de poliaminofenol. A S-adenosil-1-metionina é a ET e un intermediario común da vía biosintética de poliaminas. O mecanismo polo cal o sinal da ET regula o nivel de fenolamida necesita máis estudo.
Durante moito tempo, debido ao gran número de metabolitos especiais de estrutura descoñecida, a intensa atención a categorías metabólicas específicas non foi capaz de avaliar estritamente os cambios temporais da diversidade metabólica despois das interaccións biolóxicas. Na actualidade, segundo a análise da teoría da información, o principal resultado da adquisición do espectro MS/MS baseada en metabolitos imparciais é que os herbívoros que comen ou simulan herbívoros continúan a reducir a diversidade metabólica global do metaboloma foliar ao mesmo tempo que aumentan o seu grao de especialización. Este aumento temporal na especificidade do metaboloma causado polos herbívoros está asociado a un aumento sinérxico na especificidade do transcriptoma. A característica que máis contribúe a esta maior especialización do metaboloma (que ten un valor de Si máis alto) é o metabolito especial coa función herbívora previamente caracterizada. Este modelo é consistente coa predición da teoría OD, pero a predición de MT relacionada coa aleatoriedade da reprogramación do metaboloma non é consistente. Non obstante, estes datos tamén son consistentes coa predición do modelo mixto (mellor MT; Figura 1B), porque outros metabolitos non caracterizados con funcións de defensa descoñecidas aínda poden seguir unha distribución aleatoria de Si.
Un patrón destacable que esta investigación capta ademais é que, desde o nivel de microevolución (planta única e poboación de tabaco) ata unha escala evolutiva maior (especies de tabaco estreitamente relacionadas), os diferentes niveis de organización evolutiva están na "mellor defensa". Existen diferenzas significativas nas capacidades dos herbívoros. Moore et al. (20) e Kessler e Kalske (1) propuxeron de forma independente converter os tres niveis funcionais de biodiversidade distinguidos orixinalmente por Whittaker (50) nos cambios temporais constitutivos e inducidos da diversidade química; estes autores tampouco os resumiron. Os procedementos para a recollida de datos do metaboloma a grande escala tampouco describen como calcular a diversidade metabólica a partir destes datos. Neste estudo, os pequenos axustes á clasificación funcional de Whittaker considerarán a diversidade α-metabólica como a diversidade dos espectros de MS/MS nunha planta determinada, e a diversidade β-metabólica como o metabolismo intraespecífico básico dun grupo de poboacións, e a diversidade γ-metabólica será unha extensión da análise de especies similares.
O sinal de JA é esencial para unha ampla gama de respostas metabólicas dos herbívoros. Non obstante, faltan probas cuantitativas rigorosas sobre a contribución da regulación intraespecífica da biosíntese de JA á diversidade do metaboloma, e aínda é difícil de determinar se o sinal de JA é un sitio xeral para a diversificación metabólica inducida polo estrés a unha escala macroevolutiva superior. Observamos que a natureza herbívora de Nepenthes herbívora induce a especialización do metaboloma e a variación da especialización do metaboloma dentro da poboación de especies de Nicotiana e entre especies de Nicotiana estreitamente relacionadas está sistematicamente correlacionada positivamente coa sinalización de JA. Ademais, cando o sinal de JA se ve afectado, a especificidade metabólica inducida por un único xenotipo herbívoro cancelarase (Figura 3, C e E). Dado que os cambios no espectro metabólico das poboacións de Nepenthes atenuadas naturalmente son na súa maioría cuantitativos, os cambios na diversidade e especificidade β metabólica nesta análise poden ser causados ​​en gran medida pola forte excitación das categorías de compostos ricos en metabolitos. Estas clases de compostos dominan parte do perfil do metaboloma e conducen a unha correlación positiva cos sinais de JA.
Debido a que os mecanismos bioquímicos das especies de tabaco estreitamente relacionadas con ela son moi diferentes, os metabolitos identifícanse especificamente no aspecto cualitativo, polo que é máis analítico. O procesamento da teoría da información do perfil metabólico capturado revela que a indución herbívora exacerba a compensación entre a diversidade gamma metabólica e a especialización. O sinal de JA xoga un papel central nesta compensación. O aumento da especialización do metaboloma é consistente coa principal predición de DO e está correlacionado positivamente co sinal de JA, mentres que o sinal de JA está correlacionado negativamente coa diversidade gamma metabólica. Estes modelos indican que a capacidade de DO das plantas está determinada principalmente pola plasticidade de JA, xa sexa a escala microevolutiva ou a unha escala evolutiva maior. Os experimentos exóxenos de aplicación de JA que evitan os defectos de biosíntese de JA revelan ademais que as especies de tabaco estreitamente relacionadas pódense distinguir en especies que responden ao sinal e especies que non o fan, do mesmo xeito que o seu modo de JA e a plasticidade do metaboloma inducida polos herbívoros. As especies que non responden ao sinal non poden responder debido á súa incapacidade para producir JA endóxeno e, polo tanto, están suxeitas a limitacións fisiolóxicas. Isto pode estar causado por mutacións nalgúns xenes clave na vía de sinalización JA (AOS e JAR4 en N. crescens). Este resultado destaca que estes patróns macroevolutivos interespecies poden estar impulsados ​​principalmente por cambios na percepción e resposta hormonal interna.
Ademais da interacción entre plantas e herbívoros, a exploración da diversidade metabólica está relacionada con todos os avances teóricos importantes na investigación da adaptación biolóxica ao ambiente e a evolución de trazos fenotípicos complexos. Co aumento da cantidade de datos adquiridos polos instrumentos MS modernos, as probas de hipóteses sobre a diversidade metabólica agora poden transcender as diferenzas entre metabolitos individuais/categorías e realizar análises globais para revelar patróns inesperados. No proceso de análise a grande escala, unha metáfora importante é a idea de concibir mapas significativos que se poidan usar para explorar datos. Polo tanto, un resultado importante da combinación actual de metabolómica MS/MS imparcial e teoría da información é que proporciona unha métrica sinxela que se pode usar para construír mapas para explorar a diversidade metabólica en diferentes escalas taxonómicas. É o requisito básico deste método. O estudo da micro/macroevolución e a ecoloxía comunitaria.
A nivel macroevolutivo, o núcleo da teoría da coevolución planta-insecto de Ehrlich e Raven (51) é predicir que a variación da diversidade metabólica interespecie é a causa da diversificación das liñaxes de plantas. Non obstante, nos cincuenta anos transcorridos desde a publicación deste traballo seminal, esta hipótese foi raramente probada (52). Isto débese en gran parte ás características filoxenéticas de características metabólicas comparables en liñaxes de plantas de longa distancia. A rareza pódese usar para ancorar métodos de análise de obxectivos. O fluxo de traballo MS/MS actual procesado pola teoría da información cuantifica a semellanza estrutural MS/MS de metabolitos descoñecidos (sen selección previa de metabolitos) e converte estes MS/MS nun conxunto de MS/MS, polo que no metabolismo profesional estes modelos macroevolutivos compáranse na escala de clasificación. Indicadores estatísticos sinxelos. O proceso é similar á análise filoxenética, que pode usar o aliñamento de secuencias para cuantificar a taxa de diversificación ou a evolución dos caracteres sen predición previa.
A nivel bioquímico, a hipótese de cribado de Firn e Jones (53) mostra que a diversidade metabólica mantense a diferentes niveis para proporcionar materias primas para exercer as actividades biolóxicas de metabolitos previamente non relacionados ou substituídos. Os métodos da teoría da información proporcionan un marco no que estas transicións evolutivas específicas de metabolitos que ocorren durante a especialización de metabolitos poden cuantificarse como parte do proceso de cribado evolutivo proposto: adaptación bioloxicamente activa de baixa especificidade a alta especificidade. Metabolitos inhibidos dun ambiente determinado.
En definitiva, nos primeiros tempos da bioloxía molecular, desenvolvéronse importantes teorías de defensa das plantas, e os métodos baseados en hipóteses dedutivas considéranse amplamente o único medio de progreso científico. Isto débese en gran parte ás limitacións técnicas da medición de todo o metaboloma. Aínda que os métodos baseados en hipóteses son particularmente útiles para elixir outros mecanismos causais, a súa capacidade para avanzar na nosa comprensión das redes bioquímicas é máis limitada que os métodos computacionais dispoñibles actualmente na ciencia contemporánea de datos intensivos. Polo tanto, as teorías que non se poden predicir están moito máis alá do alcance dos datos dispoñibles, polo que a fórmula hipotética/ciclo de probas de progreso no campo da investigación non se pode abolir (4). Prevemos que o fluxo de traballo computacional da metabolómica que se presenta aquí pode reavivar o interese polas cuestións recentes (como) e finais (por que) da diversidade metabólica e contribuír a unha nova era de ciencia de datos guiada teoricamente. A era reexaminou as teorías importantes que inspiraron as xeracións anteriores.
A alimentación directa con herbívoros lévase a cabo criando unha larva de segundo estadio ou larva Sl nunha única folla de planta de cartofo de cor pálida dunha única planta con flor de rosa, con 10 réplicas de plantas por planta. As larvas de insecto foron suxeitas con pinzas e o tecido foliar restante recolleuse 24 e 72 horas despois da infección e conxelouse rapidamente, e extraéronse os metabolitos.
Simula o tratamento herbívoro dun xeito altamente sincronizado. O método consiste en usar rodas de patrón de tecido para perforar tres fileiras de espiñas a cada lado da nervadura central das tres follas completamente expandidas da planta durante a fase de crecemento da guirlanda de tecido e aplicar inmediatamente Ms diluído 1:5. Ou usa os dedos con luvas para inserir S1 OS na ferida punzante. Colle e procesa unha folla como se describe anteriormente. Usa o método descrito anteriormente para extraer metabolitos primarios e hormonas vexetais (54).
Para aplicacións exóxenas de JA, as tres follas pecioladas de cada unha das seis plantas de rosas con flor de cada especie trátanse con 20 μl de pasta de lanolina que contén 150 μg de MeJA (Lan + MeJA) e 20 μl de lanolina máis tratamento para feridas (Lan + W), ou úsanse 20 μl de lanolina pura como control. As follas recolléronse 72 horas despois do tratamento, conxeláronse rapidamente en nitróxeno líquido e almacenáronse a -80 °C ata o seu uso.
No noso grupo de investigación identificáronse catro liñas transxénicas de JA e ET, concretamente irAOC (36), irCOI1 (55), irACO e sETR1 (48). A irAOC mostrou unha forte diminución nos niveis de JA e JA-Ile, mentres que a irCOI1 non foi sensible ás JA. En comparación coa EV, a acumulación de JA-Ile aumentou. Do mesmo xeito, a irACO reducirá a produción de ET e, en comparación coa EV, a sETR1, que é insensible á ET, aumentará a produción de ET.
Emprégase un espectrómetro láser fotoacústico (sensor ET en tempo real Sensor Sense ETD-300) para realizar a medición de ET de forma non invasiva. Inmediatamente despois do tratamento, cortáronse a metade das follas e transferíronse a un vial de vidro selado de 4 ml, e deixouse acumular o espazo libre en 5 horas. Durante a medición, cada vial foi lavado cun fluxo de 2 litros/hora de aire puro durante 8 minutos, que previamente pasara a través dun catalizador proporcionado por Sensor Sense para eliminar o CO2 e a auga.
Os datos dos microarrays publicáronse orixinalmente en (35) e gardáronse na base de datos completa de expresión xénica do Centro Nacional de Información Biotecnolóxica (NCBI) (número de acceso GSE30287). Para este estudo extraéronse os datos correspondentes ás follas causadas polo tratamento con W + OSM e o control sen danos. A intensidade bruta é log2. Antes da análise estatística, a liña base converteuse e normalizouse ao seu percentil 75 usando o paquete de software R.
Os datos orixinais de secuenciación de ARN (RNA-seq) das especies de Nicotiana foron recuperados dos Arquivos de Lecturas Curtas (SRA) do NCBI, o número de proxecto é PRJNA301787, que foi publicado por Zhou et al. (39) e procedeuse como se describe en (56). Os datos brutos procesados ​​por W + W, W + OSM e W + OSS1 correspondentes ás especies de Nicotiana foron seleccionados para a análise neste estudo e procesados ​​do seguinte xeito: En primeiro lugar, as lecturas brutas de RNA-seq foron convertidas ao formato FASTQ. HISAT2 converte FASTQ a SAM e SAMtools converte os ficheiros SAM en ficheiros BAM ordenados. StringTie úsase para calcular a expresión xénica e o seu método de expresión é que hai fragmentos por cada mil fragmentos de bases por cada millón de fragmentos de transcrición secuenciados.
A columna cromatográfica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; tamaño de partícula 2,2 μm) empregada na análise e a columna de garda de 4 mm x 4 mm están compostas polo mesmo material. No sistema de cromatografía líquida de ultra alta resolución (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 utilízase o seguinte gradiente binario: de 0 a 0,5 minutos, 90 % de A isocrático [auga desionizada, 0,1 % (v/v) de acetonitrilo e 0,05 % de ácido fórmico], 10 % de B (acetonitrilo e 0,05 % de ácido fórmico); de 0,5 a 23,5 minutos, a fase de gradiente é de 10 % de A e 90 % de B, respectivamente; de ​​23,5 a 25 minutos, 10 % de A e 90 % de B isocrático. O caudal é de 400 μl/min. Para todas as análises de MS, inxectar o eluente da columna nun analizador de cuadrupolo e tempo de voo (qTOF) equipado cunha fonte de electropulverización que funciona en modo de ionización positiva (tensión capilar, 4500 V; saída capilar 130 V; temperatura de secado 200 °C; fluxo de aire de secado 10 litros/min).
Realizar unha análise de fragmentos MS/MS (en diante, MS/MS) que sexa irrelevante ou indistinguible dos datos para obter información estrutural sobre o perfil metabólico detectable global. O concepto do método MS/MS indiscriminado baséase no feito de que o cuadrupolo ten unha xanela de illamento de masa moi grande [polo tanto, considéranse todos os sinais de relación masa-carga (m/z) como fragmentos]. Por este motivo, debido a que o instrumento Impact II non foi capaz de crear unha inclinación CE, realizáronse varias análises independentes utilizando valores de enerxía de colisión (CE) de disociación inducida por colisión aumentados. En resumo, primeiro analice a mostra mediante ionización por electropulverización UHPLC/qTOF-MS utilizando o modo de espectrometría de masas única (condicións de baixa fragmentación xeradas pola fragmentación na fonte), explorando de m/z 50 a 1500 a unha frecuencia de repetición de 5 Hz. Utilice nitróxeno como gas de colisión para a análise MS/MS e realice medicións independentes nas seguintes catro voltaxes de disociación inducidas por colisión diferentes: 20, 30, 40 e 50 eV. Ao longo do proceso de medición, o cuadrupolo ten a maior xanela de illamento de masa, de m/z 50 a 1500. Cando o experimento de m/z do corpo frontal e de ancho de illamento se establece en 200, o rango de masa actívase automaticamente polo software operativo do instrumento e 0 Da. Busca fragmentos de masa como no modo de masa única. Usa formiato de sodio (50 ml de isopropanol, 200 μl de ácido fórmico e 1 ml de solución acuosa 1M de NaOH) para a calibración de masa. Usando o algoritmo de calibración de alta precisión de Bruker, o ficheiro de datos calíbrase despois de executar o espectro medio nun período de tempo determinado. Usa a función de exportación do software Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Alemaña) para converter os ficheiros de datos brutos ao formato NetCDF. O conxunto de datos MS/MS gardouse na base de datos metabolómica aberta MetaboLights (www.ebi.ac.uk) co número de acceso MTBLS1471.
A ensamblaxe MS/MS pódese realizar mediante a análise de correlación entre os sinais de calidade MS1 e MS/MS para enerxías de colisión baixas e altas e regras recentemente implementadas. O script R úsase para realizar a análise de correlación da distribución do precursor ao produto e o script C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) úsase para implementar as regras.
Para reducir os erros de falsos positivos causados ​​polo ruído de fondo e a falsa correlación causada pola detección de certas características m/z en só unhas poucas mostras, empregamos a función "pico cheo" do paquete R XCMS (para a corrección do ruído de fondo). Debería usarse para substituír a intensidade "NA" (pico non detectado). Cando se usa a función de pico cheo, aínda hai moitos valores de intensidade "0" no conxunto de datos que afectarán o cálculo da correlación. Despois, comparamos os resultados do procesamento de datos obtidos cando se usa a función de pico cheo e cando non se usa a función de pico cheo, e calculamos o valor do ruído de fondo en función do valor estimado medio corrixido, e logo substituímos estes valores de intensidade 0 polo valor de fondo calculado. Tamén só consideramos as características cuxa intensidade superaba tres veces o valor de fondo e considerámolas "picos verdadeiros". Para os cálculos de PCC, só se consideran os sinais m/z do precursor da mostra (MS1) e os conxuntos de datos de fragmentos con polo menos oito picos verdadeiros.
Se a intensidade da característica de calidade do precursor en toda a mostra está significativamente correlacionada coa intensidade reducida da mesma característica de calidade que está sometida a unha enerxía de colisión baixa ou alta, e a característica non está etiquetada como un pico isotópico por CAMERA, pódese definir máis a fondo. Entón, calculando todos os posibles pares precursor-produto dentro de 3 s (a xanela de tempo de retención estimada para a retención do pico), realízase a análise de correlación. Só cando o valor m/z é inferior ao valor do precursor e a fragmentación MS/MS se produce na mesma localización da mostra no conxunto de datos que o precursor do que deriva, considérase un fragmento.
Baseándonos nestas dúas regras sinxelas, excluímos os fragmentos especificados con valores m/z maiores que o m/z do precursor identificado e baseándonos na posición da mostra onde aparece o precursor e no fragmento especificado. Tamén é posible seleccionar as características de calidade xeradas por moitos fragmentos na fonte xerados no modo MS1 como precursores candidatos, xerando así compostos MS/MS redundantes. Para reducir esta redundancia de datos, se a semellanza NDP dos espectros supera 0,6 e pertencen ao cromatograma "pcgroup" anotado por CAMERA, fusionarémolos. Finalmente, fusionamos os catro resultados de CE asociados co precursor e os fragmentos no espectro composto deconvolucionado final seleccionando o pico de maior intensidade entre todos os picos candidatos co mesmo valor m/z a diferentes enerxías de colisión. Os pasos de procesamento posteriores baséanse no concepto de espectro composto e teñen en conta as diferentes condicións de CE necesarias para maximizar a probabilidade de fragmentación, porque algúns fragmentos só se poden detectar baixo unha enerxía de colisión específica.
O RDPI (30) empregouse para calcular a inducibilidade do perfil metabólico. A diversidade do espectro metabólico (índice Hj) derívase da abundancia de precursores de MS/MS utilizando a entropía de Shannon da distribución de frecuencias de MS/MS usando a seguinte ecuación descrita por Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) onde Pij corresponde á frecuencia relativa do i-ésimo MS/MS na j-ésima mostra (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m) t).
A especificidade metabólica (índice Si) defínese como a identidade de expresión dun MS/MS dado en relación coa frecuencia entre as mostras consideradas. A especificidade MS/MS calcúlase como Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Emprega a seguinte fórmula para medir o índice δj específico do metaboloma de cada mostra j e a media da especificidade MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Os espectros MS/MS aliñáronse por pares e a semellanza calcúlase en función das dúas puntuacións. En primeiro lugar, usando o NDP estándar (tamén coñecido como método de correlación do coseno), utilízase a seguinte ecuación para puntuar a semellanza do segmento entre os espectros. NDP = (∑iS1 e S2, WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 onde S1 e S2. De xeito correspondente, para o espectro 1 e o espectro 2, así como para WS1, i e WS2, i representa o peso baseado na intensidade do pico, de xeito que a diferenza do i-ésimo pico común entre os dous espectros é inferior a 0,01 Da. O peso calcúlase do seguinte xeito: W = [intensidade do pico] m [calidade] n, m = 0,5, n = 2, como suxire MassBank.
Implementouse un segundo método de puntuación, que implicaba analizar a NL compartida entre MS/MS. Para este fin, empregamos en tándem as 52 listas de NL que se atopan con frecuencia durante o proceso de fragmentación de MS e a NL máis específica (ficheiro de datos S1) que foi anotada previamente para o espectro MS/MS dos metabolitos secundarios das especies de Nepenthes debilitadas (9, 26). Crea un vector binario de 1 e 0 para cada MS/MS, correspondente á NL actual e á inexistente dalgúns NL respectivamente. Baseándose na semellanza da distancia euclidiana, calcúlase a puntuación de semellanza de NL para cada par de vectores binarios de NL.
Para realizar a agrupación dual, empregamos o paquete R DiffCoEx, que se basea nunha extensión da Análise de Coexpresión Xénica Ponderada (WGCNA). Usando as matrices de puntuación NDP e NL dos espectros MS/MS, empregamos DiffCoEx para calcular a matriz de correlación comparativa. A agrupación binaria realízase definindo o parámetro "cutreeDynamic" como method = "hybrid", cutHeight = 0,9999, deepSplit = T e minClusterSize = 10. O código fonte R de DiffCoEx foi descargado do ficheiro adicional 1 por Tesson et al. (57); o paquete de software R WGCNA requirido pódese atopar en https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Para realizar a análise de redes moleculares MS/MS, calculamos a conectividade espectral emparellada baseándonos nos tipos de semellanza NDP e NL e empregamos o software Cytoscape para visualizar a topoloxía da rede mediante un deseño orgánico na aplicación de extensión do algoritmo de deseño yFiles de CyFilescape.
Empregouse a versión 3.0.1 de R para realizar a análise estatística dos datos. A significación estatística avaliouse mediante unha análise de varianza bidireccional (ANOVA), seguida da proba post-hoc de diferenza honestamente significativa (HSD) de Tukey. Para analizar a diferenza entre o tratamento herbívoro e o control, analizouse a distribución bilateral dos dous grupos de mostras coa mesma varianza mediante a proba t de Student.
Para obter materiais complementarios para este artigo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Este é un artigo de acceso aberto distribuído baixo os termos da licenza Creative Commons Atribución-NonComercial, que permite o uso, a distribución e a reprodución en calquera medio, sempre que o uso final non sexa para beneficio comercial e a premisa sexa que a obra orixinal sexa correcta. Referencia.
Nota: Só che pedimos que facilites o teu enderezo de correo electrónico para que a persoa que recomendas á páxina saiba que queres que vexa o correo electrónico e que non é spam. Non capturaremos ningún enderezo de correo electrónico.
Esta pregunta úsase para comprobar se es visitante e evitar o envío automático de correo lixo.
A teoría da información proporciona unha moeda universal para a comparación de metabolomas especiais e a predición de teorías de defensa de probas.
A teoría da información proporciona unha moeda universal para a comparación de metabolomas especiais e a predición de teorías de defensa de probas.
©2021 Asociación Americana para o Avance da Ciencia. todos os dereitos reservados. AAAS é socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.