O artigo forma parte do tema de investigación "Mellora da resistencia das leguminosas a patóxenos e pragas", ver os 5 artigos
O axente causante da necrose da enfermidade fúnxica das plantas *Sclerotinia sclerotiorum* (Lib.) de Bary emprega unha estratexia de varios niveis para infectar diferentes plantas hospedadoras. Este estudo propón o uso da diamina L-ornitina, un aminoácido non proteico que estimula a síntese doutros aminoácidos esenciais, como unha estratexia de xestión alternativa para mellorar as respostas moleculares, fisiolóxicas e bioquímicas de *Phaseolus vulgaris L.* ao mofo branco causado por *Pseudomonas sclerotiorum*. Os experimentos *in vitro* demostraron que a L-ornitina inhibía significativamente o crecemento micelial de *S. pyrenoidosa* dun xeito dependente da dose. Ademais, podería reducir significativamente a gravidade do mofo branco en condicións de invernadoiro. Ademais, a L-ornitina estimulou o crecemento das plantas tratadas, o que indica que as concentracións probadas de L-ornitina non eran fitotóxicas para as plantas tratadas. Ademais, a L-ornitina mellorou a expresión de antioxidantes non encimáticos (fenólicos e flavonoides solubles totais) e antioxidantes encimáticos (catalase (CAT), peroxidase (POX) e polifenol oxidase (PPO)) e aumentou a expresión de tres xenes relacionados cos antioxidantes (PvCAT1, PvSOD e PvGR). Por outra banda, a análise in silico revelou a presenza dunha suposta proteína oxaloacetato acetilhidrolase (SsOAH) no xenoma de S. sclerotiorum, que era moi similar ás proteínas oxaloacetato acetilhidrolase (SsOAH) de Aspergillus fijiensis (AfOAH) e Penicillium sp. (PlOAH) en termos de análise funcional, dominios conservados e topoloxía. Curiosamente, a adición de L-ornitina ao medio caldo de dextrosa de pataca (PDB) reduciu significativamente a expresión do xene SsOAH nos micelios de S. sclerotiorum. Do mesmo xeito, a aplicación exóxena de L-ornitina reduciu significativamente a expresión do xene SsOAH nos micelios fúnxicos recollidos das plantas tratadas. Finalmente, a aplicación de L-ornitina reduciu significativamente a secreción de ácido oxálico tanto no medio PDB como nas follas infectadas. En conclusión, a L-ornitina xoga un papel fundamental no mantemento do estado redox, así como na mellora da resposta defensiva das plantas infectadas. Os resultados deste estudo poden axudar a desenvolver métodos innovadores e respectuosos co medio ambiente para controlar o mofo branco e mitigar o seu impacto na produción de fabas e outros cultivos.
O mofo branco, causado polo fungo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, é unha enfermidade devastadora que reduce o rendemento e supón unha seria ameaza para a produción mundial de fabas (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). A Sclerotinia sclerotiorum é un dos patóxenos fúnxicos das plantas transmitidos polo solo máis difíciles de controlar, cunha ampla gama de hóspedes de máis de 600 especies de plantas e a capacidade de macerar rapidamente os tecidos hóspedes dun xeito non específico (Liang e Rollins, 2018). En condicións desfavorables, sofre unha fase crítica do seu ciclo de vida, permanecendo latente durante longos períodos de tempo como estruturas negras, duras e semellantes a sementes chamadas "esclerocios" no solo ou como crecementos brancos e esponxosos no micelio ou na medula do talo das plantas infectadas (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum é capaz de formar esclerocios, o que lle permite sobrevivir en campos infectados durante longos períodos de tempo e persistir durante a enfermidade (Schwartz et al., 2005). Os esclerocios son ricos en nutrientes, poden persistir no solo durante longos períodos e serven como inóculo principal para infeccións posteriores (Schwartz et al., 2005). En condicións favorables, os esclerocios xerminan e producen esporas transportadas polo aire que poden infectar todas as partes aéreas da planta, incluíndo, entre outras, flores, talos ou vainas (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum emprega unha estratexia multinivel para infectar as súas plantas hospedadoras, que implica unha serie de eventos coordinados desde a xerminación esclerocial ata o desenvolvemento dos síntomas. Inicialmente, S. sclerotiorum produce esporas en suspensión (chamadas ascosporas) a partir de estruturas semellantes a cogomelos chamadas apotecios, que se transportan polo aire e se desenvolven en esclerocios non móbiles nos restos vexetais infectados (Bolton et al., 2006). O fungo segrega entón ácido oxálico, un factor de virulencia, para controlar o pH da parede celular da planta, promover a degradación encimática e a invasión dos tecidos (Hegedus e Rimmer, 2005) e suprimir a explosión oxidativa da planta hospedadora. Este proceso de acidificación debilita a parede celular da planta, proporcionando un ambiente favorable para o funcionamento normal e eficiente dos encimas degradantes da parede celular dos fungos (CWDE), o que permite que o patóxeno supere a barreira física e penetre nos tecidos hospedadores (Marciano et al., 1983). Unha vez penetrada, S. sclerotiorum segrega varios compostos orgánicos asociados a patóxenos (CWDE), como a poligalacturonase e a celulase, que facilitan a súa diseminación nos tecidos infectados e causan necrose tisular. A progresión das lesións e os tapetes hifais leva aos síntomas característicos do mofo branco (Hegedus e Rimmer, 2005). Mentres tanto, as plantas hospedadoras recoñecen os patróns moleculares asociados a patóxenos (PAMP) a través dos receptores de recoñecemento de patróns (PRR), o que desencadea unha serie de eventos de sinalización que finalmente activan as respostas de defensa.
Malia décadas de esforzos para controlar enfermidades, a escaseza de xermoplasma resistente axeitado persiste no feixón, como noutros cultivos comerciais, debido á resistencia, supervivencia e adaptabilidade do patóxeno. Polo tanto, a xestión de enfermidades é extremadamente complexa e require unha estratexia integrada e multifacética que inclúa unha combinación de prácticas culturais, control biolóxico e funxicidas químicos (O'Sullivan et al., 2021). O control químico do mofo branco é o máis eficaz porque os funxicidas, cando se aplican correctamente e no momento adecuado, poden controlar eficazmente a propagación da enfermidade, reducir a gravidade da infección e minimizar as perdas de rendemento. Non obstante, o uso excesivo e a dependencia excesiva dos funxicidas poden levar á aparición de cepas resistentes de S. sclerotiorum e ter un impacto negativo nos organismos non obxectivo, na saúde do solo e na calidade da auga (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Polo tanto, atopar alternativas respectuosas co medio ambiente converteuse nunha prioridade máxima.
As poliaminas (AP), como a putrescina, a espermidina, a espermina e a cadaverina, poden servir como alternativas prometedoras contra os patóxenos vexetais transmitidos polo solo, reducindo así total ou parcialmente o uso de funxicidas químicos perigosos (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Nas plantas superiores, os AP están implicados en moitos procesos fisiolóxicos, incluíndo, entre outros, a división celular, a diferenciación e a resposta a estreses abióticos e bióticos (Killiny e Nehela, 2020). Poden actuar como antioxidantes, axudar a eliminar especies reactivas de osíxeno (ROS), manter a homeostase redox (Nehela e Killiny, 2023), inducir xenes relacionados coa defensa (Romero et al., 2018), regular varias vías metabólicas (Nehela e Killiny, 2023), modular as fitohormonas endóxenas (Nehela e Killiny, 2019), establecer resistencia sistémica adquirida (SAR) e regular as interaccións planta-patóxeno (Nehela e Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Cómpre sinalar que os mecanismos e funcións específicos dos ácidos grasos na defensa das plantas varían dependendo das especies vexetais, os patóxenos e as condicións ambientais. Os ácidos grasos máis abundantes nas plantas biosintetízanse a partir da poliamina esencial L-ornitina (Killiny e Nehela, 2020).
A L-ornitina desempeña múltiples funcións no crecemento e desenvolvemento das plantas. Por exemplo, estudos previos demostraron que no arroz (Oryza sativa), a ornitina pode estar asociada coa reciclaxe de nitróxeno (Liu et al., 2018), o rendemento, a calidade e o aroma do arroz (Lu et al., 2020) e a resposta ao estrés hídrico (Yang et al., 2000). Ademais, a aplicación exóxena de L-ornitina mellorou significativamente a tolerancia á seca na remolacha azucreira (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) e aliviou o estrés salino nas plantas de cebola (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu e Çavuşoǧlu, 2021) e anacardo (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). O posible papel da L-ornitina na defensa contra o estrés abiótico pode deberse á súa implicación na acumulación de prolina nas plantas tratadas. Por exemplo, xa se informou previamente de que xenes relacionados co metabolismo da prolina, como os xenes da ornitina delta aminotransferase (delta-OAT) e da prolina deshidroxenase (ProDH1 e ProDH2), están implicados na defensa de Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana contra cepas non hóspedes de Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar e Mysore, 2012). Por outra banda, a ornitina descarboxilase (ODC) fúnxica é necesaria para o crecemento dos patóxenos (Singh et al., 2020). A focalización das ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici mediante o silenciamento xénico inducido polo hóspede (HIGS) mellorou significativamente a resistencia das plantas de tomate á murcha por Fusarium (Singh et al., 2020). Non obstante, o papel potencial da aplicación exóxena de ornitina contra estreses bióticos como os fitopatóxenos non foi ben estudado. Máis importante aínda, os efectos da ornitina na resistencia ás enfermidades e os fenómenos bioquímicos e fisiolóxicos asociados seguen sendo en gran parte inexplorados.
Comprender a complexidade da infección por S. sclerotiorum nas leguminosas é importante para o desenvolvemento de estratexias de control eficaces. Neste estudo, o noso obxectivo foi identificar o papel potencial da diamina L-ornitina como factor clave na mellora dos mecanismos de defensa e a resistencia das plantas leguminosas á infección por Sclerotinia sclerotiorum. A nosa hipótese é que, ademais de mellorar as respostas de defensa das plantas infectadas, a L-ornitina tamén xoga un papel clave no mantemento do estado redox. Propoñemos que os posibles efectos da L-ornitina están relacionados coa regulación dos mecanismos de defensa antioxidantes encimáticos e non encimáticos e coa interferencia cos factores de patoxenicidade/virulencia fúnxica e as proteínas asociadas. Esta dobre funcionalidade da L-ornitina convértea nunha candidata prometedora para unha estratexia sostible para mitigar o impacto do mofo branco e mellorar a resistencia dos cultivos de leguminosas comúns a este potente patóxeno fúnxico. Os resultados do presente estudo poden axudar no desenvolvemento de métodos innovadores e respectuosos co medio ambiente para controlar o mofo branco e mitigar o seu impacto na produción de leguminosas.
Neste estudo, empregouse como material experimental unha variedade comercial susceptible de faba común, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). O Departamento de Investigación de Leguminosas do Instituto de Investigación de Cultivos de Campo (FCRI) do Centro de Investigación Agrícola (ARC) de Exipto proporcionou amablemente sementes sas. Sementáronse cinco sementes en macetas de plástico (diámetro interior 35 cm, profundidade 50 cm) cheas de solo infectado con S. sclerotiorum en condicións de invernadoiro (25 ± 2 °C, humidade relativa 75 ± 1 %, 8 h de luz/16 h de escuridade). Aos 7-10 días da sementeira (DPS), as mudas foron clareadas para deixar só dúas mudas cun crecemento uniforme e tres follas completamente expandidas en cada maceta. Todas as plantas en maceta regáronse unha vez cada dúas semanas e fertilizáronse mensualmente á taxa recomendada para a variedade dada.
Para preparar unha concentración de 500 mg/L de L-ornitinadiamina (tamén coñecida como ácido (+)-(S)-2,5-diaminopentanoico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemaña), primeiro disolvéronse 50 mg en 100 mL de auga destilada estéril. A continuación, diluíuse a solución madre e utilizouse en experimentos posteriores. En resumo, probáronse in vitro seis series de concentracións de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L). Ademais, utilizouse auga destilada estéril como control negativo (Mock) e como control positivo utilizouse o funxicida comercial "Rizolex-T" en po humectable ao 50 % (toclofos-metilo ao 20 % + tiram ao 30 %; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, gobernación de Gharbia, Exipto). O funxicida comercial "Rizolex-T" probouse in vitro en cinco concentracións (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L).
Recolléronse mostras de talos e vainas de fabas comúns que presentaban síntomas típicos de mofo branco (taxa de infestación: 10–30 %) en explotacións agrícolas comerciais. Aínda que a maioría dos materiais vexetais infectados foron identificados por especie/variedade (variedade comercial susceptible Giza 3), outros, especialmente os obtidos nos mercados locais, eran de especies descoñecidas. Os materiais infectados recollidos foron primeiro desinfectados superficialmente cunha solución de hipoclorito de sodio ao 0,5 % durante 3 minutos, despois enxaugados varias veces con auga destilada estéril e secados con papel de filtro estéril para eliminar o exceso de auga. Os órganos infectados foron entón cortados en pequenos anacos do tecido medio (entre os tecidos sans e os infectados), cultivados en medio de ágar dextrosa de pataca (PDA) e incubados a 25 ± 2 °C cun ciclo de 12 h de luz/12 h de escuridade durante 5 días para estimular a formación de esclerocios. O método da punta micelial tamén se utilizou para purificar illados de fungos de cultivos mesturados ou contaminados. O illado de fungos purificado identificouse primeiro en función das súas características morfolóxicas culturais e despois confirmouse que era S. sclerotiorum en función das características microscópicas. Finalmente, analizáronse a patoxenicidade de todos os illados purificados no cultivar de faba común susceptible Giza 3 para cumprir cos postulados de Koch.
Ademais, o illado de S. sclerotiorum máis invasivo (illado nº 3) confirmouse aínda máis baseándose na secuenciación con espazador transcrito interno (ITS), tal e como describen White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. En resumo, os illados cultiváronse en caldo de dextrosa de pataca (PDB) e incubáronse a 25 ± 2 °C durante 5–7 días. Despois, recolleuse o micelio fúnxico, filtrouse a través dunha gasa, lavouse dúas veces con auga estéril e secouse con papel de filtro estéril. O ADN xenómico illouse usando o kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). A continuación, amplificouse a rexión de ARNr ITS empregando o par de cebadores específico ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; tamaño esperado: 540 pb) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Os produtos de PCR purificados enviáronse para secuenciación (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). As secuencias de ARNr ITS secuenciáronse bidireccionalmente empregando o método de secuenciación Sanger. As secuencias de consulta ensambladas comparáronse cos datos máis recentes de GenBank e do Centro Nacional de Información Biotecnolóxica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) empregando o software BLASTn. A secuencia de consulta comparouse con outras 20 cepas/illados de S. sclerotiorum recuperados dos datos máis recentes de NCBI GenBank (Táboa suplementaria S1) empregando ClustalW no Paquete de Análise Xenética Evolutiva Molecular (MEGA-11; versión 11) (Kumar et al., 2024). A análise evolutiva realizouse empregando o método de máxima verosimilitude e o modelo xeral de substitución de nucleótidos reversible no tempo (Nei e Kumar, 2000). Móstrase a árbore coa maior verosimilitude logarítmica. A árbore inicial para a busca heurística selecciónase escollendo a árbore coa maior verosimilitude logarítmica entre a árbore de unión de neighbors (NJ) (Kumar et al., 2024) e a árbore de máxima parsimonia (MP). A árbore NJ construíuse empregando unha matriz de distancias por pares calculada empregando o modelo xeral reversible no tempo (Nei e Kumar, 2000).
A actividade antibacteriana da L-ornitina e do bactericida "Rizolex-T" determinouse in vitro mediante o método de difusión en ágar. Método: Tomouse a cantidade axeitada da solución stock de L-ornitina (500 mg/L) e mestúrase ben con 10 ml do medio nutritivo PDA para preparar solucións con concentracións finais de 12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L, respectivamente. Utilizáronse cinco concentracións do funxicida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L) e auga destilada estéril como control. Despois de que o medio solidificase, transferiuse ao centro da placa de Petri un tapón micelial recentemente preparado do cultivo de Sclerotinia sclerotiorum, de 4 mm de diámetro, e cultivouse a 25 ± 2 °C ata que o micelio cubriu toda a placa de Petri de control, tras o cal se rexistrou o crecemento do fungo. Calcula a porcentaxe de inhibición do crecemento radial de S. sclerotiorum usando a ecuación 1:
O experimento repetiuse dúas veces, con seis réplicas biolóxicas para cada grupo de control/experimental e cinco macetas (dúas plantas por maceta) para cada réplica biolóxica. Cada réplica biolóxica analizouse dúas veces (dúas réplicas técnicas) para garantir a precisión, a fiabilidade e a reproducibilidade dos resultados experimentais. Ademais, utilizouse unha análise de regresión probit para calcular a concentración inhibitoria semimáxima (IC50) e a IC99 (Prentice, 1976).
Para avaliar o potencial da L-ornitina en condicións de invernadoiro, realizáronse dous experimentos consecutivos en macetas. En resumo, as macetas enchíronse con terra arxilo-areosa esterilizada (3:1) e inoculáronse cun cultivo de S. sclerotiorum recentemente preparado. En primeiro lugar, cultivouse o illado máis invasivo de S. sclerotiorum (illado nº 3) cortando un esclerocio pola metade, colocándoo boca abaixo nun PDA e incubándose a 25 °C en escuridade constante (24 h) durante 4 días para estimular o crecemento micelial. A continuación, tomáronse catro tapóns de ágar de 5 mm de diámetro do bordo dianteiro e inoculáronse con 100 g dunha mestura estéril de farelo de trigo e arroz (1:1, v/v) e todos os frascos incubáronse a 25 ± 2 °C baixo un ciclo de 12 h de luz/12 h de escuridade durante 5 días para estimular a formación de esclerocios. O contido de todos os frascos mesturouse completamente para garantir a homoxeneidade antes de engadir a terra. Despois, engadíronse 100 g da mestura de farelo colonizadora a cada maceta para garantir unha concentración constante de patóxenos. As macetas inoculadas regáronse para activar o crecemento de fungos e colocáronse en condicións de invernadoiro durante 7 días.
A continuación, sementáronse cinco sementes da variedade Giza 3 en cada maceta. Para as macetas tratadas con L-ornitina e o funxicida Rizolex-T, as sementes esterilizadas remolláronse primeiro durante dúas horas nunha solución acuosa dos dous compostos cunha concentración final de CI99 de aproximadamente 250 mg/L e 50 mg/L, respectivamente, e despois secáronse ao aire durante unha hora antes da sementeira. Por outra banda, as sementes remolláronse en auga destilada estéril como control negativo. Despois de 10 días, antes do primeiro rego, as mudas foron clareadas, deixando só dúas mudas limpas en cada maceta. Ademais, para garantir a infección con S. sclerotiorum, cortáronse talos de plantas de faba na mesma fase de desenvolvemento (10 días) en dous lugares diferentes usando un bisturí esterilizado e colocáronse aproximadamente 0,5 g da mestura de farelo colonizadora en cada ferida, seguido de alta humidade para estimular a infección e o desenvolvemento da enfermidade en todas as plantas inoculadas. As plantas de control foron feridas de xeito similar e colocouse unha cantidade igual (0,5 g) dunha mestura de farelo estéril e non colonizada na ferida, mantívose en condicións de alta humidade para simular o ambiente para o desenvolvemento da enfermidade e garantir a consistencia entre os grupos de tratamento.
Método de tratamento: As mudas de faba regáronse con 500 ml dunha solución acuosa de L-ornitina (250 mg/l) ou o funxicida Rizolex-T (50 mg/l) mediante rego do solo, e despois o tratamento repetiuse tres veces cun intervalo de 10 días. Os controis tratados con placebo regáronse con 500 ml de auga destilada estéril. Todos os tratamentos realizáronse en condicións de invernadoiro (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % de humidade relativa e un fotoperíodo de 8 h de luz/16 h de escuridade). Todas as macetas regáronse cada dúas semanas e tratáronse mensualmente cun fertilizante NPK equilibrado (20-20-20, con 3,6 % de xofre e microelementos TE; Zain Seeds, Exipto) a unha concentración de 3–4 g/l mediante pulverización foliar segundo as recomendacións para a variedade específica e as instrucións do fabricante. A menos que se indique o contrario, as follas maduras completamente expandidas (2ª e 3ª follas desde arriba) recolléronse de cada réplica biolóxica ás 72 h posteriores ao tratamento (hpt), homoxeneizáronse, agrupáronse e almacenáronse a -80 °C para análises posteriores, incluíndo, entre outras, a localización histoquímica in situ de indicadores de estrés oxidativo, peroxidación lipídica, antioxidantes encimáticos e non encimáticos e expresión xénica.
A intensidade da infección por mofo branco avaliouse semanalmente 21 días despois da inoculación (dpi) usando unha escala de 1 a 9 (Táboa suplementaria S2) baseada na escala de Petzoldt e Dickson (1996) modificada por Teran et al. (2006). En resumo, examináronse os talos e as ramas das plantas de faba comezando no punto de inoculación para seguir a progresión das lesións ao longo dos internodos e nós. A continuación, mediuse a distancia da lesión desde o punto de inoculación ata o punto máis afastado ao longo do talo ou a rama e asignouse unha puntuación de 1 a 9 en función da localización da lesión, onde (1) indicaba que non había infección visible preto do punto de inoculación e (2 a 9) indicaba un aumento gradual no tamaño da lesión e na progresión ao longo dos nós/internodos (Táboa suplementaria S2). A intensidade da infección por mofo branco converteuse entón en porcentaxe usando a fórmula 2:
Ademais, a área baixo a curva de progresión da enfermidade (AUDPC) calculouse empregando a fórmula (Shaner e Finney, 1977), que foi adaptada recentemente para a podremia branca da faba común (Chauhan et al., 2020) usando a ecuación 3:
Onde Yi = gravidade da enfermidade no tempo ti, Yi+1 = gravidade da enfermidade no seguinte tempo ti+1, ti = hora da primeira medición (en días), ti+1 = hora da seguinte medición (en días), n = número total de puntos temporais ou puntos de observación. Os parámetros de crecemento da planta de faba, incluíndo a altura da planta (cm), o número de pólas por planta e o número de follas por planta, rexistráronse semanalmente durante 21 días en todas as réplicas biolóxicas.
En cada réplica biolóxica, recolléronse mostras de follas (segunda e terceira folla completamente desenvolvida desde a parte superior) o día 45 despois do tratamento (15 días despois do último tratamento). Cada réplica biolóxica constaba de cinco macetas (dúas plantas por maceta). Empregáronse uns 500 mg do tecido triturado para a extracción de pigmentos fotosintéticos (clorofila a, clorofila b e carotenoides) usando acetona ao 80 % a 4 °C na escuridade. Despois de 24 h, centrifugáronse as mostras e recolleuse o sobrenadante para a determinación colorimetrica do contido de clorofila a, clorofila b e carotenoides usando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Xapón) segundo o método de (Lichtenthaler, 1987) medindo a absorbancia a tres lonxitudes de onda diferentes (A470, A646 e A663 nm). Finalmente, o contido de pigmentos fotosintéticos calculouse usando as seguintes fórmulas 4–6 descritas por Lichtenthaler (1987).
Ás 72 h despois do tratamento (hpt), recolléronse follas (segunda e terceira folla completamente desenvolvida desde a parte superior) de cada réplica biolóxica para a localización histoquímica in situ do peróxido de hidróxeno (H2O2) e o anión superóxido (O2•−). Cada réplica biolóxica constaba de cinco macetas (dúas plantas por maceta). Cada réplica biolóxica analizouse por duplicado (dúas réplicas técnicas) para garantir a precisión, a fiabilidade e a reproducibilidade do método. O H2O2 e o O2•− determináronse usando 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemaña) ou tetrazolio nitroazul (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemaña), respectivamente, seguindo os métodos descritos por Romero-Puertas et al. (2004) e Adam et al. (1989) con pequenas modificacións. Para a localización histoquímica do H2O2 in situ, os folíolos infiltráronse ao baleiro con DAB ao 0,1 % en tampón Tris a 10 mM (pH 7,8) e despois incubáronse a temperatura ambiente á luz durante 60 minutos. Os folíolos branqueáronse en TCA ao 0,15 % (v/v) en etanol:cloroformo 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, O Cairo, Exipto) e despois expuxéronse á luz ata que escureceron. Do mesmo xeito, as valvas infiltráronse ao baleiro con tampón de fosfato de potasio a 10 mM (pH 7,8) que contiña HBT ao 0,1 % p/v para a localización histoquímica do O2•− in situ. Os folíolos incubáronse á luz a temperatura ambiente durante 20 minutos, despois branqueáronse como se indicou anteriormente e logo ilumináronse ata que apareceron manchas azul escuras/violeta. A intensidade da cor marrón resultante (como indicador de H2O2) ou azul violeta (como indicador de O2•−) avaliouse empregando a versión para Fiji do paquete de procesamento de imaxes ImageJ (http://fiji.sc; consultado o 7 de marzo de 2024).
O malondialdehído (MDA; como marcador da peroxidación lipídica) determinouse segundo o método de Du e Bramlage (1992) con lixeiras modificacións. As follas de cada réplica biolóxica (segunda e terceira folla completamente desenvolvida desde a parte superior) recolléronse 72 horas despois do tratamento (hpt). Cada réplica biolóxica incluía cinco macetas (dúas plantas por maceta). Cada réplica biolóxica analizouse por duplicado (dúas réplicas técnicas) para garantir a precisión, a fiabilidade e a reproducibilidade do método. En resumo, utilizáronse 0,5 g de tecido foliar moído para a extracción de MDA cun 20 % de ácido tricloroacético (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA) que contiña un 0,01 % de hidroxitolueno butilado (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). O contido de MDA no sobrenadante determinouse colorimetricamente medindo a absorbancia a 532 e 600 nm usando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Xapón) e expresouse como nmol g−1 FW.
Para a avaliación dos antioxidantes encimáticos e non encimáticos, recolléronse follas (segunda e terceira folla completamente desenvolvida desde a parte superior) de cada réplica biolóxica ás 72 horas posteriores ao tratamento (hpt). Cada réplica biolóxica constaba de cinco macetas (dúas plantas por maceta). Cada mostra biolóxica analizouse por duplicado (dúas mostras técnicas). Moíronse dúas follas con nitróxeno líquido e utilizáronse directamente para a determinación de antioxidantes encimáticos e non encimáticos, aminoácidos totais, contido de prolina, expresión xénica e cuantificación de oxalato.
Os compostos fenólicos totais solubles determináronse empregando o reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) con lixeiras modificacións do método descrito por Kahkonen et al. (1999). En resumo, extraéronse aproximadamente 0,1 g de tecido foliar homoxenizado con 20 ml de metanol ao 80 % na escuridade durante 24 h e o sobrenadante recolleuse despois da centrifugación. Mesturáronse 0,1 ml do extracto da mostra con 0,5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu (10 %), axitáronse durante 30 s e deixáronse na escuridade durante 5 min. Despois, engadíronse 0,5 ml dunha solución de carbonato de sodio ao 20 % (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, O Cairo, Exipto) a cada tubo, mesturáronse completamente e incubáronse a temperatura ambiente na escuridade durante 1 h. Despois da incubación, a absorbancia da mestura de reacción mediuse a 765 nm empregando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Xapón). A concentración de fenois totais solubles nos extractos da mostra determinouse empregando unha curva de calibración de ácido gálico (Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA) e expresouse como miligramos de equivalente de ácido gálico por gramo de peso fresco (mg GAE g-1 peso fresco).
O contido total de flavonoides solubles determinouse segundo o método de Djeridane et al. (2006) con lixeiras modificacións. En resumo, mesturáronse 0,3 ml do extracto de metanol anterior con 0,3 ml de solución de cloruro de aluminio ao 5 % (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA), axitáronse vigorosamente e incubáronse a temperatura ambiente durante 5 minutos, seguido da adición de 0,3 ml de solución de acetato de potasio ao 10 % (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Exipto), mesturáronse completamente e incubáronse a temperatura ambiente durante 30 minutos na escuridade. Despois da incubación, mediuse a absorbancia da mestura de reacción a 430 nm cun espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Xapón). A concentración de flavonoides solubles totais nos extractos de mostra determinouse usando unha curva de calibración de rutina (TCI America, Portland, OR, EUA) e expresouse como miligramos de equivalente de rutina por gramo de peso fresco (mg RE g-1 peso fresco).
O contido total de aminoácidos libres das follas de faba determinouse empregando un reactivo de ninhidrina modificado (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA) baseado no método proposto por Yokoyama e Hiramatsu (2003) e modificado por Sun et al. (2006). En resumo, extraéronse 0,1 g de tecido moído cun tampón de pH 5,4 e 200 μL do sobrenadante reaccionaron con 200 μL de ninhidrina (2 %) e 200 μL de piridina (10 %; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, EUA), incubáronse nun baño de auga fervendo durante 30 minutos, despois arrefriáronse e mediuse a 580 nm empregando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Xapón). Por outra banda, a prolina determinouse mediante o método Bates (Bates et al., 1973). A prolina extraeuse con ácido sulfosalicílico ao 3 % (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA) e, despois da centrifugación, mesturáronse 0,5 ml do sobrenadante con 1 ml de ácido acético glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA) e reactivo de ninhidrina, incubouse a 90 °C durante 45 min, arrefriouse e mediuse a 520 nm usando o mesmo espectrofotómetro que o anterior. Os aminoácidos libres totais e a prolina nos extractos de follas determináronse usando curvas de calibración de glicina e prolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), respectivamente, e expresáronse como mg/g de peso fresco.
Para determinar a actividade encimática dos encimas antioxidantes, extraéronse aproximadamente 500 mg de tecido homoxenizado con 3 ml de tampón Tris 50 mM (pH 7,8) que contiña 1 mM de EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 7,5 % de polivinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), centrifugáronse a 10 000 × g durante 20 min en refrixeración (4 °C) e recolleuse o sobrenadante (extracto encimático bruto) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A continuación, a catalase (CAT) reaccionou con 2 ml de tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 100 μl de solución de H2O2 a 269 mM para determinar a súa actividade encimática segundo o método de Aebi (1984) con lixeiras modificacións (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A actividade encimática da peroxidase dependente do guaiacol (POX) determinouse empregando o método de Harrach et al. (2009). (2008) con pequenas modificacións (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) e a actividade encimática da polifenol oxidase (PPO) determinouse tras a reacción con 2,2 ml de tampón fosfato de sodio 100 mM (pH 6,0), 100 μl de guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, EUA) e 100 μl de H2O2 12 mM. O método modificouse lixeiramente con respecto a (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). O ensaio realizouse tras a reacción con 3 ml de solución de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA) (0,01 M) preparada recentemente en tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0). A actividade de CAT mediuse monitorizando a descomposición de H2O2 a 240 nm (A240), a actividade de POX mediuse monitorizando o aumento da absorbancia a 436 nm (A436) e a actividade de PPO mediuse rexistrando as flutuacións de absorbancia a 495 nm (A495) cada 30 s durante 3 min usando un espectrofotómetro UV-160A (Shimadzu, Xapón).
A RT-PCR en tempo real utilizouse para detectar os niveis de transcrición de tres xenes relacionados cos antioxidantes, incluíndo a catalase peroxisomal (PvCAT1; nº de acceso do GenBank KF033307.1), a superóxido dismutase (PvSOD; nº de acceso do GenBank XM_068639556.1) e a glutatión redutase (PvGR; nº de acceso do GenBank KY195009.1), en follas de faba (a segunda e a terceira folla completamente desenvolvida desde a parte superior) 72 h despois do último tratamento. En resumo, o ARN illouse usando o kit de extracción de ARN total Simply P (nº de cat. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) segundo o protocolo do fabricante. Despois, o ADNc sintetizouse usando o kit de síntese de ADNc TOP script™ segundo as instrucións do fabricante. As secuencias de cebadores dos tres xenes anteriores están listadas na Táboa suplementaria S3. PvActin-3 (número de acceso de GenBank: XM_068616709.1) empregouse como xene de referencia e a expresión xénica relativa calculouse mediante o método 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001). Demostrouse a estabilidade da actina baixo estrés biótico (interacción incompatible entre as leguminosas comúns e o fungo antracnose Colletotrichum lindemuthianum) e estrés abiótico (seca, salinidade, baixa temperatura) (Borges et al., 2012).
Inicialmente realizamos unha análise in silico de todo o xenoma das proteínas da oxaloacetato acetilhidrolase (OAH) en S. sclerotiorum empregando a ferramenta proteína-proteína BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). En resumo, empregamos OAH de Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxídeo: 1191702; número de acceso de GenBank XP_040799428.1; 342 aminoácidos) e Penicillium lagena (PlOAH; taxídeo: 94218; número de acceso de GenBank XP_056833920.1; 316 aminoácidos) como secuencias de consulta para mapear a proteína homóloga en S. sclerotiorum (taxídeo: 5180). O estudo BLASTp realizouse cos datos xenómicos de S. sclerotiorum dispoñibles máis recentemente en GenBank, no sitio web do Centro Nacional de Información Biotecnolóxica (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Ademais, o xene OAH predito de S. sclerotiorum (SsOAH) e a análise evolutiva e a árbore filoxenética de AfOAH de A. fijiensis CBS 313.89 e PlOAH de P. lagena inferíronse empregando o método de máxima verosimilitude en MEGA11 (Tamura et al., 2021) e o modelo baseado na matriz JTT (Jones et al., 1992). A árbore filoxenética combinouse coa análise de aliñamento múltiple das secuencias de proteínas de todos os xenes OAH preditos (SsOAH) de S. sclerotiorum e a secuencia de consulta empregando a Ferramenta de aliñamento baseada en restricións (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos e Agarwala, 2007). Ademais, as secuencias de aminoácidos que mellor coinciden de SsOAH de S. sclerotiorum aliñáronse coas secuencias de consulta (AfOAH e PlOAH) (Larkin et al., 2007) usando ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), e as rexións conservadas no aliñamento visualizáronse usando a ferramenta ESPript (versión 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Ademais, os dominios representativos funcionais e os sitios conservados de SsOAH de S. sclerotiorum preditos clasificáronse de forma interactiva en diferentes familias empregando a ferramenta InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Finalmente, realizouse unha modelización da estrutura tridimensional (3D) da SsOAH de S. sclerotiorum predita empregando o motor de recoñecemento de homoloxía/analoxía de proteínas (servidor Phyre2 versión 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) e validouse empregando o servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). As estruturas tridimensionais preditas (en formato PDB) visualizáronse de forma interactiva empregando o paquete UCSF-Chimera (versión 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Empregouse a PCR cuantitativa de fluorescencia en tempo real para determinar o nivel transcricional da oxaloacetato acetilhidrolase (SsOAH; número de acceso de GenBank: XM_001590428.1) nos micelios de Sclerotinia sclerotiorum. En resumo, inoculouse S. sclerotiorum nun frasco que contiña PDB e colocouse nunha incubadora con axitación (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EUA) a 25 ± 2 °C durante 24 h a 150 rpm e en escuridade constante (24 h) para estimular o crecemento micelial. Despois, as células tratáronse con L-ornitina e o funxicida Rizolex-T a concentracións finais de IC50 (aproximadamente 40 e 3,2 mg/L, respectivamente) e logo cultiváronse durante outras 24 h nas mesmas condicións. Tras a incubación, os cultivos centrifugáronse a 2500 rpm durante 5 minutos e recolleuse o sobrenadante (micelio fúnxico) para a análise da expresión xénica. Do mesmo xeito, recolleuse micelio fúnxico ás 0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas posteriores á infección de plantas infectadas que formaran mofo branco e micelio algodonoso na superficie dos tecidos infectados. Extraeuse ARN do micelio fúnxico e logo sintetizouse ADNc como se describiu anteriormente. As secuencias de cebadores para SsOAH aparecen na Táboa suplementaria S3. Utilizouse SsActin (número de acceso de GenBank: XM_001589919.1) como xene de referencia e a expresión xénica relativa calculouse mediante o método 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001).
O ácido oxálico determinouse en caldo de dextrosa de pataca (PDB) e en mostras de plantas que contiñan o patóxeno fúnxico Sclerotinia sclerotiorum segundo o método de Xu e Zhang (2000) con lixeiras modificacións. En resumo, os illamentos de S. sclerotiorum inoculáronse en frascos que contiñan PDB e despois cultiváronse nunha incubadora con axitación (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EUA) a 150 rpm a 25 ± 2 °C durante 3-5 días en escuridade constante (24 h) para estimular o crecemento micelial. Despois da incubación, o cultivo fúnxico filtrouse primeiro a través de papel de filtro Whatman n.º 1 e despois centrifugouse a 2500 rpm durante 5 minutos para eliminar o micelio residual. O sobrenadante recolleuse e almacenouse a 4 °C para unha maior determinación cuantitativa do oxalato. Para a preparación de mostras de plantas, extraéronse aproximadamente 0,1 g de fragmentos de tecido vexetal tres veces con auga destilada (2 ml cada vez). As mostras foron centrifugadas a 2500 rpm durante 5 minutos, o sobrenadante filtrouse en seco a través de papel de filtro Whatman n.º 1 e recolleuse para a súa análise posterior.
Para a análise cuantitativa do ácido oxálico, a mestura de reacción preparouse nun tubo con tapón de vidro na seguinte orde: 0,2 ml de mostra (ou filtrado de cultivo PDB ou solución estándar de ácido oxálico), 0,11 ml de azul de bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, EUA), 0,198 ml de ácido sulfúrico 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, O Cairo, Exipto) e 0,176 ml de dicromato de potasio 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, EUA), e despois a solución diluíuse a 4,8 ml con auga destilada, mesturouse vigorosamente e colocouse inmediatamente nun baño de auga a 60 °C. Despois de 10 minutos, a reacción detívose engadindo 0,5 ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH; 0,75 M). A absorbancia (A600) da mestura de reacción mediuse a 600 nm empregando un espectrofotómetro UV-160 (Shimadzu Corporation, Xapón). Empregáronse PDB e auga destilada como controis para a cuantificación dos filtrados de cultivo e das mostras de plantas, respectivamente. As concentracións de ácido oxálico nos filtrados de cultivo, expresadas como microgramos de ácido oxálico por mililitro de medio PDB (μg.mL−1), e nos extractos de follas, expresadas como microgramos de ácido oxálico por gramo de peso fresco (μg.g−1 FW), determináronse empregando unha curva de calibración de ácido oxálico (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA).
Ao longo do estudo, todos os experimentos foron deseñados cun deseño completamente aleatorizado (CRD) con seis réplicas biolóxicas por tratamento e cinco macetas por réplica biolóxica (dúas plantas por maceta), a menos que se indique o contrario. As réplicas biolóxicas analizáronse por duplicado (dúas réplicas técnicas). As réplicas técnicas utilizáronse para comprobar a reproducibilidade do mesmo experimento, pero non se utilizaron na análise estatística para evitar réplicas espurias. Os datos analizáronse estatisticamente mediante análise de varianza (ANOVA) seguida da proba de diferenza honestamente significativa (HSD) de Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Para os experimentos in vitro, os valores de IC50 e IC99 calculáronse utilizando o modelo probit e calculáronse intervalos de confianza do 95 %.
Recolléronse un total de catro illamentos de diferentes campos de soia na gobernación de El Ghabiya, Exipto. No medio PDA, todos os illamentos produciron micelio branco cremoso que se tornou rapidamente branco algodonoso (Figura 1A) e despois beis ou marrón na fase de esclerocio. Os esclerocios adoitan ser densos, negros, esféricos ou irregulares, de 5,2 a 7,7 mm de longo e 3,4 a 5,3 mm de diámetro (Figura 1B). Aínda que catro illamentos desenvolveron un patrón marxinal de esclerocios no bordo do medio de cultivo despois de 10-12 días de incubación a 25 ± 2 °C (Fig. 1A), o número de esclerocios por placa foi significativamente diferente entre eles (P < 0,001), sendo o illamento 3 o que tivo o maior número de esclerocios (32,33 ± 1,53 esclerocios por placa; Fig. 1C). Do mesmo xeito, o illado nº 3 produciu máis ácido oxálico no PDB que outros illados (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). O illado nº 3 mostrou características morfolóxicas e microscópicas típicas do fungo fitopatóxeno Sclerotinia sclerotiorum. Por exemplo, no PDA, as colonias do illado nº 3 creceron rapidamente, eran de cor branco cremosa (Figura 1A), beis inverso ou amarelo-marrón salmón claro e necesitaron de 6 a 7 días a 25 ± 2 °C para cubrir completamente a superficie dunha placa de 9 cm de diámetro. En base ás características morfolóxicas e microscópicas anteriores, o illado nº 3 identificouse como Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Características e patoxenicidade dos illamentos de S. sclerotiorum de cultivos comúns de leguminosas. (A) Crecemento micelial de catro illamentos de S. sclerotiorum en medio PDA, (B) esclerocios de catro illamentos de S. sclerotiorum, (C) número de esclerocios (por placa), (D) secreción de ácido oxálico en medio PDB (μg.mL−1) e (E) gravidade da enfermidade (%) de catro illamentos de S. sclerotiorum no cultivar de leguminosa comercial susceptible Giza 3 en condicións de invernadoiro. Os valores representan a media ± desviación estándar de cinco réplicas biolóxicas (n = 5). Letras diferentes indican diferenzas estatisticamente significativas entre tratamentos (p < 0,05). (F–H) Os síntomas típicos de mofo branco apareceron en talos e siliques aéreas, respectivamente, 10 días despois da inoculación co illado nº 3 (dpi). (I) A análise evolutiva da rexión do espazador transcrito interno (ITS) do illado n.º 3 de S. sclerotiorum realizouse empregando o método de máxima verosimilitude e comparouse con 20 illados/cepas de referencia obtidos da base de datos do Centro Nacional de Información Biotecnolóxica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os números por riba das liñas de agrupamento indican a cobertura da rexión (%) e os números por debaixo das liñas de agrupamento indican a lonxitude da rama.
Ademais, para confirmar a patoxenicidade, empregáronse catro illamentos de S. sclerotiorum obtidos para inocular o cultivar comercial de faba Giza 3 susceptible en condicións de invernadoiro, o que é consistente cos postulados de Koch (Fig. 1E). Aínda que todos os illamentos de fungos obtidos eran patóxenos e podían infectar a faba verde (cv. Giza 3), causando síntomas típicos de mofo branco en todas as partes aéreas (Fig. 1F), especialmente nos talos (Fig. 1G) e nas vainas (Fig. 1H) aos 10 días posteriores á inoculación (dpi), o illamento 3 foi o illamento máis agresivo en dous experimentos independentes. O illamento 3 tivo a maior gravidade da enfermidade (%) nas plantas de faba (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 e 76,7 ± 3,1 aos 7, 14 e 21 días posteriores á infección, respectivamente; Figura 1F).
A identificación do illado de S. sclerotiorum nº 3, o máis invasivo, confirmouse aínda máis con base na secuenciación con espazador transcrito interno (ITS) (Fig. 1I). A análise filoxenética entre o illado nº 3 e 20 illados/cepas de referencia mostrou unha alta semellanza (>99 %) entre eles. Cómpre sinalar que o illado de S. sclerotiorum nº 3 (533 pb) ten unha alta semellanza co illado americano de S. sclerotiorum LPM36 illado de sementes de chícharos secos (número de acceso do GenBank MK896659.1; 540 pb) e co illado chinés de S. sclerotiorum YKY211 (número de acceso do GenBank OR206374.1; 548 pb), que causa a podremia do talo da violeta (Matthiola incana), todos os cales se agrupan por separado na parte superior do dendrograma (Figura 1I). A nova secuencia foi depositada na base de datos do NCBI e denominada “Sclerotinia sclerotiorum – illamento YN-25” (número de acceso ao GenBank PV202792). Pódese observar que o illamento 3 é o illamento máis invasivo; polo tanto, este illamento foi escollido para o estudo en todos os experimentos posteriores.
Investigouse in vitro a actividade antibacteriana da diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemaña) a diferentes concentracións (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) contra o illado 3 de S. sclerotiorum. É importante salientar que a L-ornitina exerceu un efecto antibacteriano e inhibiu gradualmente o crecemento radial das hifas de S. sclerotiorum de maneira dependente da dose (Figura 2A, B). Na concentración máis alta probada (125 mg/L), a L-ornitina demostrou a maior taxa de inhibición do crecemento micelial (99,62 ± 0,27 %; Figura 2B), que foi equivalente ao funxicida comercial Rizolex-T (taxa de inhibición 99,45 ± 0,39 %; Figura 2C) na concentración máis alta probada (10 mg/L), o que indica unha eficacia similar.
Figura 2. Actividade antibacteriana in vitro da L-ornitina contra Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparación da actividade antibacteriana de diferentes concentracións de L-ornitina contra S. sclerotiorum co funxicida comercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Taxa de inhibición (%) do crecemento micelial de S. sclerotiorum despois do tratamento con diferentes concentracións de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) ou Rizolex-T (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L), respectivamente. Os valores representan a media ± desviación estándar de cinco réplicas biolóxicas (n = 5). As letras diferentes indican diferenzas estatísticas entre os tratamentos (p < 0,05). (D, E) Análise de regresión do modelo probit da L-ornitina e o funxicida comercial Rizolex-T, respectivamente. A liña de regresión do modelo probit móstrase como unha liña azul continua e o intervalo de confianza (95 %) como unha liña vermella descontinua.
Ademais, realizouse unha análise de regresión probit e as gráficas correspondentes móstranse na Táboa 1 e nas Figuras 2D e E. En resumo, o valor da pendente aceptable (y = 2,92x − 4,67) e as estatísticas significativas asociadas (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 e p < 0,0001; Figura 2D) da L-ornitina indicaron unha actividade antifúnxica mellorada contra S. sclerotiorum en comparación co funxicida comercial Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 e p < 0,0001) (Táboa 1).
Táboa 1. Valores da concentración inhibitoria metade-máxima (CI50) e da CI99 (mg/l) de L-ornitina e do funxicida comercial "Rizolex-T" contra S. sclerotiorum.
En xeral, a L-ornitina (250 mg/L) reduciu significativamente o desenvolvemento e a gravidade do mofo branco nas plantas de faba común tratadas en comparación coas plantas infectadas con S. sclerotiorum non tratadas (control; Figura 3A). En resumo, aínda que a gravidade da enfermidade nas plantas de control infectadas non tratadas aumentou gradualmente (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 e 92,33 ± 3,06%), a L-ornitina reduciu significativamente a gravidade da enfermidade (%) ao longo do experimento (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 e 26,36 ± 3,07) aos 7, 14 e 21 días posteriores ao tratamento (dpt), respectivamente (Figura 3A). Do mesmo xeito, cando se trataron plantas de faba infectadas con S. sclerotiorum con 250 mg/L de L-ornitina, a área baixo a curva de progresión da enfermidade (AUDPC) diminuíu de 1274,33 ± 33,13 no control non tratado a 281,03 ± 7,95, un valor lixeiramente inferior ao do control positivo de 50 mg/L de funxicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). A mesma tendencia observouse no segundo experimento.
Fig. 3. Efecto da aplicación exóxena de L-ornitina no desenvolvemento da podremia branca da faba común causada por Sclerotinia sclerotiorum en condicións de invernadoiro. (A) Curva de progresión da enfermidade do mofo branco da faba común despois do tratamento con 250 mg/L de L-ornitina. (B) Área baixo a curva de progresión da enfermidade (AUDPC) do mofo branco da faba común despois do tratamento con L-ornitina. Os valores representan a media ± desviación estándar de cinco réplicas biolóxicas (n = 5). As letras diferentes denotan diferenzas estatisticamente significativas entre os tratamentos (p < 0,05).
A aplicación exóxena de 250 mg/L de L-ornitina aumentou gradualmente a altura da planta (Fig. 4A), o número de pólas por planta (Fig. 4B) e o número de follas por planta (Fig. 4C) despois de 42 días. Mentres que o funxicida comercial Rizolex-T (50 mg/L) tivo o maior efecto en todos os parámetros nutricionais estudados, a aplicación exóxena de 250 mg/L de L-ornitina tivo o segundo maior efecto en comparación cos controis non tratados (Figs. 4A–C). Por outra banda, o tratamento con L-ornitina non tivo un efecto significativo sobre o contido de pigmentos fotosintéticos clorofila a (Fig. 4D) e clorofila b (Fig. 4E), pero aumentou lixeiramente o contido total de carotenoides (0,56 ± 0,03 mg/g peso fr) en comparación co control negativo (0,44 ± 0,02 mg/g peso fr) e o control positivo (0,46 ± 0,02 mg/g peso fr; Fig. 4F). En xeral, estes resultados indican que a L-ornitina non é fitotóxica para as leguminosas tratadas e mesmo pode estimular o seu crecemento.
Fig. 4. Efecto da aplicación exóxena de L-ornitina sobre as características de crecemento e os pigmentos fotosintéticos das follas de faba infectadas con Sclerotinia sclerotiorum en condicións de invernadoiro. (A) Altura da planta (cm), (B) Número de ramas por planta, (C) Número de follas por planta, (D) Contido de clorofila a (mg g-1 fr wt), (E) Contido de clorofila b (mg g-1 fr wt), (F) Contido total de carotenoides (mg g-1 fr wt). Os valores son a media ± desviación estándar de cinco réplicas biolóxicas (n = 5). Letras diferentes indican diferenzas estatisticamente significativas entre os tratamentos (p < 0,05).
A localización histoquímica in situ de especies reactivas de osíxeno (ROS; expresadas como peróxido de hidróxeno [H2O2]) e radicais libres (expresados ​​como anións superóxido [O2•−]) revelou que a aplicación exóxena de L-ornitina (250 mg/L) reduciu significativamente a acumulación de H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) e O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) en comparación coa acumulación tanto de plantas infectadas non tratadas (173,31 ± 12,06 e 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respectivamente) como de plantas tratadas con 50 mg/L do funxicida comercial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 e 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectivamente) ás 72 h. Acumuláronse altos niveis de H2O2 e O2•− baixo a temperatura de alta temperatura (Fig. 5A, B). Do mesmo xeito, o ensaio de malondialdehído (MDA) baseado en TCA mostrou que as plantas de feixón infectadas con S. sclerotiorum acumulaban niveis máis altos de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g en peso propio) nas súas follas (Fig. 5C). Non obstante, a aplicación exóxena de L-ornitina reduciu significativamente a peroxidación lipídica, como o demostra a diminución do contido de MDA nas plantas tratadas (33,08 ± 4,00 nmol.g en peso propio).
Fig. 5. Efecto da aplicación exóxena de L-ornitina sobre os principais marcadores de estrés oxidativo e mecanismos de defensa antioxidantes non encimáticos en follas de faba infectadas con S. sclerotiorum ás 72 h posteriores á infección en condicións de invernadoiro. (A) Peróxido de hidróxeno (H2O2; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (B) anión superóxido (O2•−; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (C) malondialdehído (MDA; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (D) fenois solubles totais (mg GAE g−1 FW) a 72 hpt, (E) flavonoides solubles totais (mg RE g−1 FW) a 72 hpt, (F) aminoácidos libres totais (mg g−1 FW) a 72 hpt e (G) contido de prolina (mg g−1 FW) a 72 hpt. Os valores representan a media ± desviación estándar (media ± DE) de 5 réplicas biolóxicas (n = 5). Letras diferentes indican diferenzas estatisticamente significativas entre tratamentos (p < 0,05).