Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, mostraremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
As nanopartículas de insulina (NP) con alto contido de carga atoparon diferentes aplicacións en diferentes formas de dosificación. Este traballo ten como obxectivo avaliar o efecto dos procesos de liofilización e secado por pulverización na estrutura das nanopartículas de quitosano cargadas con insulina, con ou sen manitol como crioprotector. Tamén avaliamos a calidade destas nanopartículas redisolvéndoas. Antes da deshidratación, o tamaño das partículas das nanopartículas reticuladas de quitosano/tripolifosfato de sodio/insulina optimizouse para ser de 318 nm, o PDI foi de 0,18, a eficiencia de encapsulación foi do 99,4 % e a carga foi do 25,01 %. Despois da reconstitución, todas as nanopartículas, excepto as producidas por un método de liofilización sen o uso de manitol, mantiveron a súa estrutura de partículas esféricas. En comparación coas nanopartículas que conteñen manitol deshidratadas por pulverización, as nanopartículas secadas por pulverización sen manitol tamén mostraron o tamaño medio de partícula máis pequeno (376 nm) e o maior contido de carga. (25,02 %) cunha taxa de encapsulación similar (98,7 %) e PDI (0,20) mediante técnicas de secado ou liofilización. As nanopartículas secadas mediante secado por pulverización sen manitol tamén resultaron na liberación máis rápida de insulina e na maior eficiencia de absorción celular. Este traballo demostra que o secado por pulverización pode deshidratar as nanopartículas de insulina sen necesidade de crioprotectores en comparación cos métodos convencionais de liofilización, creando unha maior capacidade de carga, menores requisitos de aditivos e unha vantaxe significativa nos custos operativos.
Desde o seu descubrimento en 19221,2,3, a insulina e as súas preparacións farmacéuticas salvaron a vida de pacientes con diabetes tipo 1 (DM1) e diabetes tipo 2 (DM1). Non obstante, debido ás súas propiedades como proteína de alto peso molecular, a insulina agrégase facilmente, descomponse mediante encimas proteolíticos e elimínase polo efecto de primeira pasaxe. As persoas diagnosticadas con diabetes tipo 1 necesitan inxeccións de insulina para o resto das súas vidas. Moitos pacientes diagnosticados inicialmente con diabetes tipo 2 tamén requiren inxeccións de insulina a longo prazo. As inxeccións diarias de insulina son unha fonte grave de dor e incomodidade diarias para estas persoas, con efectos negativos na saúde mental. Como resultado, outras formas de administración de insulina que causan menos incomodidade, como a administración oral de insulina, están a ser amplamente estudadas5, xa que teñen o potencial de restaurar a calidade de vida de aproximadamente 5.000 millóns de persoas con diabetes en todo o mundo.
A tecnoloxía das nanopartículas proporcionou un avance significativo nos intentos de administrar insulina oral4,6,7. Unha que encapsula e protexe eficazmente a insulina da degradación para a súa administración dirixida a partes específicas do corpo. Non obstante, o uso de formulacións de nanopartículas ten varias limitacións, principalmente debido a problemas de estabilidade das suspensións de partículas. Pode producirse certa agregación durante o almacenamento, o que reduce a biodispoñibilidade das nanopartículas cargadas de insulina8. Ademais, tamén se debe ter en conta a estabilidade química da matriz polimérica das nanopartículas e da insulina para garantir a estabilidade das nanopartículas de insulina (NP). Actualmente, a tecnoloxía de liofilización é o estándar de ouro para crear NP estables e evitar cambios non desexados durante o almacenamento9.
Non obstante, a liofilización require a adición de crioprotectores para evitar que a estrutura esférica das nanopartículas se vexa afectada pola tensión mecánica dos cristais de xeo. Isto reduce significativamente a carga de nanopartículas de insulina despois da liofilización, xa que o crioprotector ocupa a maior parte da relación en peso. Polo tanto, as nanopartículas de insulina producidas adoitan ser inadecuadas para a fabricación de formulacións de po seco, como comprimidos orais e películas orais, debido á necesidade de grandes cantidades de nanopartículas secas para alcanzar a xanela terapéutica da insulina.
O secado por pulverización é un proceso a escala industrial ben coñecido e económico para producir pos secos a partir de fases líquidas na industria farmacéutica10,11. O control sobre o proceso de formación de partículas permite a encapsulación axeitada de varios compostos bioactivos12, 13. Ademais, converteuse nunha técnica eficaz para a preparación de proteínas encapsuladas para administración oral. Durante o secado por pulverización, a auga evapórase moi rapidamente, o que axuda a manter baixa a temperatura do núcleo da partícula11,14, o que permite a súa aplicación para encapsular compoñentes sensibles á calor. Antes do secado por pulverización, o material de revestimento debe homoxenizarse completamente coa solución que contén os ingredientes encapsulados11,14. A diferenza da liofilización, a homoxenización antes da encapsulación no secado por pulverización mellora a eficiencia da encapsulación durante a deshidratación. Dado que o proceso de encapsulación por secado por pulverización non require crioprotectores, o secado por pulverización pódese usar para producir nanopartículas secas cun alto contido de carga.
Este estudo informa da produción de nanopartículas cargadas con insulina mediante a reticulación de quitosano e tripolifosfato de sodio usando un método de xel iónico. A xelificación iónica é un método de preparación que permite a produción de nanopartículas mediante interaccións electrostáticas entre dúas ou máis especies iónicas baixo certas condicións. Utilizáronse técnicas de liofilización e secado por pulverización para deshidratar as nanopartículas reticuladas optimizadas de quitosano/tripolifosfato de sodio/insulina. Despois da deshidratación, analizouse a súa morfoloxía mediante SEM. A súa capacidade de recombinación avaliouse medindo a súa distribución de tamaño, carga superficial, PDI, eficiencia de encapsulación e contido de carga. Tamén se avaliou a calidade das nanopartículas resolubilizadas producidas por diferentes métodos de deshidratación comparando a súa protección contra a insulina, o seu comportamento de liberación e a súa eficacia de absorción celular.
O pH da solución mesturada e a proporción de quitosano e insulina son dous factores clave que afectan o tamaño das partículas e a eficiencia de encapsulación (EE) das nanopartículas finais, xa que afectan directamente o proceso de xelificación ionotrópica. Demostrouse que o pH da solución mesturada está altamente correlacionado co tamaño das partículas e a eficiencia de encapsulación (Fig. 1a). Como se mostra na Fig. 1a, a medida que o pH aumentaba de 4,0 a 6,0, o tamaño medio das partículas (nm) diminuía e o EE aumentaba significativamente, mentres que cando o pH aumentaba a 6,5, o tamaño medio das partículas comezaba a aumentar e o EE permanecía sen cambios. A medida que a proporción de quitosano e insulina aumenta, o tamaño medio das partículas tamén aumenta. Ademais, non se observou ningún cambio no EE cando as nanopartículas se prepararon cunha proporción de masa de quitosano/insulina superior a 2,5:1 (p/p) (Fig. 1b). Polo tanto, utilizáronse as condicións óptimas de preparación neste estudo (pH 6,0, proporción de masa de quitosano/insulina de 2,5:1). preparar nanopartículas cargadas con insulina para estudos posteriores. Nesta condición de preparación, o tamaño medio das partículas das nanopartículas de insulina optimizouse para ser de 318 nm (Fig. 1c), o PDI foi de 0,18, a eficiencia de incrustación foi do 99,4 %, o potencial zeta foi de 9,8 mv e a carga de insulina foi do 25,01 % (m/m). Segundo os resultados da microscopía electrónica de transmisión (TEM), as nanopartículas optimizadas eran aproximadamente esféricas e discretas, cun tamaño relativamente uniforme (Fig. 1d).
Optimización de parámetros de nanopartículas de insulina: (a) o efecto do pH no diámetro medio e na eficiencia de encapsulación (EE) das nanopartículas de insulina (preparadas cunha proporción de masa de 5:1 de quitosano e insulina); (b) quitosano e influencia da proporción de masa da insulina no diámetro medio e na eficiencia de encapsulación (EE) das nanopartículas de insulina (preparadas a pH 6); (c) distribución do tamaño das partículas das nanopartículas de insulina optimizadas; (d) micrografía TEM de nanopartículas de insulina optimizadas.
É ben sabido que a quitosana é un polielectrólito débil cun pKa de 6,5. Cárgase positivamente en medios ácidos porque o seu principal grupo amino está protonado por ións de hidróxeno15. Polo tanto, úsase a miúdo como portador para encapsular macromoléculas cargadas negativamente. Neste estudo, utilizouse a quitosana para encapsular insulina cun punto isoeléctrico de 5,3. Dado que a quitosana se utiliza como material de revestimento, co aumento da súa proporción, o grosor da capa exterior das nanopartículas aumenta correspondentemente, o que resulta nun tamaño medio de partícula maior. Ademais, niveis máis altos de quitosana poden encapsular máis insulina. No noso caso, o EE foi maior cando a proporción de quitosana e insulina alcanzou 2,5:1, e non houbo un cambio significativo no EE cando a proporción seguiu aumentando.
Ademais da proporción de quitosano e insulina, o pH tamén xogou un papel crucial na preparación de nanopartículas. Gan et al. 17 estudaron o efecto do pH no tamaño das partículas das nanopartículas de quitosano. Atoparon unha diminución continua no tamaño das partículas ata que o pH alcanzou 6,0 e observouse un aumento significativo no tamaño das partículas a pH > 6,0, o que é consistente coas nosas observacións. Este fenómeno débese ao feito de que ao aumentar o pH, a molécula de insulina adquire unha carga superficial negativa, o que favorece as interaccións electrostáticas co complexo quitosano/tripolifosfato de sodio (TPP), o que resulta nun tamaño de partícula pequeno e un EE alto. Non obstante, cando o pH se axustou a 6,5, os grupos amino da quitosano desprotonáronse, o que provocou o pregamento da quitosano. Polo tanto, un pH alto resulta nunha menor exposición de ións amino ao TPP e á insulina, o que resulta nunha menor reticulación, un maior tamaño medio final de partícula e un EE máis baixo.
A análise das propiedades morfolóxicas das nanopartículas liofilizadas e pulverizadas pode guiar a selección de mellores técnicas de deshidratación e formación de po. O método preferido debe proporcionar estabilidade do fármaco, forma uniforme das partículas, alta carga de fármaco e boa solubilidade na solución orixinal. Neste estudo, para comparar mellor as dúas técnicas, utilizáronse nanopartículas de insulina con ou sen manitol ao 1 % durante a deshidratación. O manitol utilízase como axente de volume ou crioprotector en varias formulacións de po seco para liofilización e pulverización. Para as nanopartículas de insulina liofilizadas sen manitol, como se mostra na Figura 2a, observouse unha estrutura de po altamente porosa con superficies grandes, irregulares e rugosas baixo microscopía electrónica de varrido (SEM). Detectáronse poucas partículas discretas no po despois da deshidratación (Fig. 2e). Estes resultados indicaron que a maioría das nanopartículas se descompuxeron durante a liofilización sen ningún crioprotector. Para as nanopartículas de insulina liofilizadas e pulverizadas que conteñen manitol ao 1 %, observáronse nanopartículas esféricas con superficies lisas (Fig. 2b, d, f, h). As nanopartículas de insulina secadas por pulverización sen manitol permaneceron esféricas pero engurradas na superficie (Fig. 2c). As superficies esféricas e engurradas discútense máis a fondo nas probas de comportamento de liberación e absorción celular que se mostran a continuación. En función da aparencia visible das nanopartículas secadas, tanto as nanopartículas secadas por pulverización sen manitol como as nanopartículas liofilizadas e secadas por pulverización con manitol produciron pós finos de nanopartículas (Fig. 2f, g, h). Canto maior sexa a superficie entre as superficies das partículas, maior será a solubilidade e, polo tanto, maior será a taxa de liberación.
Morfoloxía de diferentes nanopartículas de insulina deshidratadas: (a) imaxe SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas sen manitol; (b) imaxe SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas con manitol; (c) nanopartículas de insulina secadas por pulverización sen manitol; (d) imaxe SEM de nanopartículas de insulina secadas por pulverización con manitol; (e) imaxe de po de nanopartículas de insulina liofilizadas sen manitol; (f) imaxe de nanopartículas de insulina liofilizadas con manitol; (g) Imaxe de po de nanopartículas de insulina secadas por pulverización sen manitol; (h) imaxe de po de nanopartículas de insulina secadas por pulverización con manitol.
Durante a liofilización, o manitol actúa como crioprotector, mantendo as nanopartículas nunha forma amorfa e evitando danos causados ​​por cristais de xeo19. Pola contra, non hai ningún paso de conxelación durante a secado por pulverización. Polo tanto, o manitol non se require neste método. De feito, as nanopartículas secadas por pulverización sen manitol produciron nanopartículas máis finas como se describiu anteriormente. Non obstante, o manitol aínda pode actuar como recheo no proceso de secado por pulverización para darlles ás nanopartículas unha estrutura máis esférica20 (Fig. 2d), o que axuda a obter un comportamento de liberación uniforme destas nanopartículas encapsuladas. Ademais, está claro que se poden detectar algunhas partículas grandes tanto nas nanopartículas de insulina liofilizadas como nas secadas por pulverización que conteñen manitol (Fig. 2b,d), o que pode deberse á acumulación de manitol no núcleo da partícula xunto coa insulina encapsulada. Capa de quitosano. Cómpre sinalar que neste estudo, para garantir que a estrutura esférica permaneza intacta despois da deshidratación, a proporción de manitol e quitosano mantense en 5:1, de xeito que unha gran cantidade de recheo tamén pode aumentar o tamaño das partículas das nanopartículas secas.
A espectroscopia de reflexión total atenuada por infravermellos transformados de Fourier (FTIR-ATR) caracterizou a mestura física de insulina libre, quitosano, quitosano, TPP e insulina. Todas as nanopartículas deshidratadas caracterizáronse mediante espectroscopia FTIR-ATR. En particular, observáronse intensidades de banda de 1641, 1543 e 1412 cm-1 en nanopartículas encapsuladas liofilizadas con manitol e en nanopartículas secadas por pulverización con e sen manitol (Fig. 3). Como se informou anteriormente, estes aumentos de forza asociáronse coa reticulación entre a quitosano, o TPP e a insulina. A investigación da interacción entre a quitosano e a insulina mostrou que nos espectros FTIR de nanopartículas de quitosano cargadas con insulina, a banda de quitosano solapábase coa da insulina, aumentando a intensidade do carbonilo (1641 cm-1) e o cinto de amina (1543 cm-1). Os grupos tripolifosfato do TPP están ligados a grupos amonio na quitosano, formando unha banda a 1412 cm-1.
Espectros FTIR-ATR de insulina libre, quitosano, mesturas físicas de quitosano/TPP/insulina e nanopartículas deshidratadas por diferentes métodos.
Ademais, estes resultados son consistentes cos mostrados en SEM, que mostraron que as nanopartículas encapsuladas permaneceron intactas tanto cando se pulverizaron como se liofilizaron con manitol, pero en ausencia de manitol, só a pulverización produciu partículas encapsuladas. En contraste, os resultados espectrais FTIR-ATR das nanopartículas liofilizadas sen manitol foron moi similares á mestura física de quitosano, TPP e insulina. Este resultado indica que as ligazóns cruzadas entre a quitosano, o TPP e a insulina xa non están presentes nas nanopartículas liofilizadas sen manitol. A estrutura das nanopartículas foi destruída durante a liofilización sen crioprotector, o que se pode ver nos resultados de SEM (Fig. 2a). Baseándose na morfoloxía e nos resultados de FTIR das nanopartículas de insulina deshidratadas, só se usaron nanopartículas liofilizadas, liofilizadas e sen manitol para os experimentos de reconstitución e nanopartículas sen manitol debido á descomposición das nanopartículas sen manitol durante a deshidratación. debate.
A deshidratación utilízase para o almacenamento a longo prazo e o reprocesamento noutras formulacións. A capacidade das nanopartículas secas para reconstituírse despois do almacenamento é fundamental para o seu uso en diferentes formulacións, como comprimidos e películas. Observamos que o tamaño medio das partículas das nanopartículas de insulina secadas por pulverización en ausencia de manitol aumentou só lixeiramente despois da reconstitución. Por outra banda, o tamaño das partículas das nanopartículas de insulina secadas por pulverización e liofilizadas con manitol aumentou significativamente (Táboa 1). A PDI e a EE non cambiaron significativamente (p > 0,05) despois da recombinación de todas as nanopartículas neste estudo (Táboa 1). Este resultado indica que a maioría das partículas permaneceron intactas despois da redisolución. Non obstante, a adición de manitol resultou nunha gran redución da carga de insulina das nanopartículas de manitol liofilizadas e secadas por pulverización (Táboa 1). Pola contra, o contido de carga de insulina das nanopartículas secadas por pulverización sen manitol mantívose igual que antes (Táboa 1).
É ben sabido que a carga de nanopartículas é fundamental cando se empregan para a administración de fármacos. Para as nanopartículas con baixas cargas, requírense grandes cantidades de material para alcanzar o limiar terapéutico. Non obstante, a alta viscosidade destas concentracións elevadas de nanopartículas provoca inconvenientes e dificultades na administración oral e nas formulacións inxectables, respectivamente 22. Ademais, as nanopartículas de insulina tamén se poden empregar para fabricar comprimidos e biopelículas viscosas 23, 24, o que require o uso de grandes cantidades de nanopartículas a baixos niveis de carga, o que resulta en comprimidos grandes e biopelículas grosas que non son axeitadas para aplicacións orais. Polo tanto, as nanopartículas deshidratadas cunha alta carga de insulina son moi desexables. Os nosos resultados suxiren que a alta carga de insulina das nanopartículas secadas por pulverización sen manitol pode ofrecer moitas vantaxes atractivas para estes métodos de administración alternativos.
Todas as nanopartículas deshidratadas gardáronse no frigorífico durante tres meses. Os resultados do SEM mostraron que a morfoloxía de todas as nanopartículas deshidratadas non cambiou significativamente durante os tres meses de almacenamento (Fig. 4). Despois da reconstitución en auga, todas as nanopartículas mostraron unha lixeira diminución no EE e liberaron aproximadamente unha pequena cantidade (~5 %) de insulina durante o período de almacenamento de tres meses (Táboa 2). Non obstante, o tamaño medio das partículas de todas as nanopartículas aumentou. O tamaño das partículas das nanopartículas secadas por pulverización sen manitol aumentou a 525 nm, mentres que o das nanopartículas secadas por pulverización e liofilizadas con manitol aumentou a 872 e 921 nm, respectivamente (Táboa 2).
Morfoloxía de diferentes nanopartículas de insulina deshidratadas almacenadas durante tres meses: (a) imaxe SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas con manitol; (b) imaxe SEM de nanopartículas de insulina secadas por pulverización sen manitol; (c) sen manitol Imaxes SEM de nanopartículas de insulina secadas por pulverización.
Ademais, observáronse precipitados nas nanopartículas de insulina reconstituídas secadas por pulverización con manitol e liofilizadas (Fig. S2). Isto pode deberse a que as partículas grandes non se suspenden correctamente na auga. Todos os resultados anteriores demostran que a técnica de secado por pulverización pode protexer as nanopartículas de insulina da deshidratación e que se poden obter altas cargas de nanopartículas de insulina sen ningún tipo de recheo nin crioprotector.
A retención de insulina probouse nun medio de pH = 2,5 con pepsina, tripsina e α-quimotripsina para demostrar a capacidade protectora das nanopartículas contra a dixestión encimática despois da deshidratación. A retención de insulina das nanopartículas deshidratadas comparouse coa das nanopartículas recentemente preparadas e a insulina libre utilizouse como control negativo. Neste estudo, a insulina libre mostrou unha rápida eliminación da insulina en 4 horas nos tres tratamentos encimáticos (Fig. 5a-c). En contraste, as probas de eliminación de insulina de nanopartículas liofilizadas con manitol e nanopartículas secadas por pulverización con ou sen manitol mostraron unha protección significativamente maior destas nanopartículas contra a dixestión encimática, que foi similar á das nanopartículas de insulina recentemente preparadas (figura 1).5a-c). Coa axuda de nanopartículas en pepsina, tripsina e α-quimotripsina, máis do 50 %, 60 % e 75 % da insulina puido protexerse en 4 horas, respectivamente (Fig. 5a-c). Este protector da insulina A capacidade pode aumentar a probabilidade dunha maior absorción de insulina na corrente sanguínea25. Estes resultados suxiren que o secado por pulverización con ou sen manitol e a liofilización con manitol poden preservar a capacidade protectora da insulina das nanopartículas despois da deshidratación.
Comportamento de protección e liberación de nanopartículas de insulina deshidratadas: (a) protección da insulina en solución de pepsina; (b) protección da insulina en solución de tripsina; (c) protección da insulina por solución de α-quimotripsina; (d) comportamento de liberación de nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 2,5; (e) comportamento de liberación de nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 6,6; (f) comportamento de liberación de nanopartículas deshidratadas en solución de pH = 7,0.
As nanopartículas de insulina secas preparadas e reconstituídas foron incubadas en varios tampóns (pH = 2,5, 6,6, 7,0) a 37 °C, simulando o ambiente de pH do estómago, o duodeno e a parte superior do intestino delgado, para examinar o efecto da insulina sobre a resistencia á insulina. Comportamento de liberación en diferentes ambientes. Fragmento do tracto gastrointestinal. A pH = 2,5, as nanopartículas cargadas de insulina e as nanopartículas de insulina seca resolubilizadas mostraron unha liberación inicial en ráfagas dentro da primeira hora, seguida dunha liberación lenta durante as seguintes 5 horas (Fig. 5d). Esta liberación rápida ao principio é moi probablemente o resultado da rápida desorción superficial de moléculas de proteína que non están completamente inmobilizadas na estrutura interna da partícula. A pH = 6,5, as nanopartículas cargadas de insulina e as nanopartículas de insulina seca reconstituídas mostraron unha liberación suave e lenta durante 6 h, xa que o pH da solución de proba era similar ao da solución preparada con nanopartículas (Fig. 5e). A pH = 7, as nanopartículas eran inestables e descompuxéronse case por completo nas dúas primeiras horas (Fig. 5f). Isto débese a que a desprotonación do quitosano ocorre a pH máis alto, o que resulta nunha rede de polímeros menos compacta e na liberación de insulina cargada.
Ademais, as nanopartículas de insulina secadas por pulverización sen manitol mostraron un perfil de liberación máis rápido que as outras nanopartículas deshidratadas (Fig. 5d-f). Como se describiu anteriormente, as nanopartículas de insulina reconstituídas secadas sen manitol mostraron o tamaño de partícula máis pequeno. As partículas pequenas proporcionan unha maior superficie, polo que a maior parte do fármaco relevante estará na superficie da partícula ou preto dela, o que resulta nunha liberación rápida do fármaco26.
A citotoxicidade das nanopartículas (NP) investigouse mediante o ensaio MTT. Como se mostra na Figura S4, descubriuse que todas as NP deshidratadas non tiñan un efecto significativo sobre a viabilidade celular en concentracións de 50–500 μg/ml, o que suxire que todas as NP deshidratadas pódense usar con seguridade para alcanzar a xanela terapéutica.
O fígado é o principal órgano a través do cal a insulina exerce as súas funcións fisiolóxicas. As células HepG2 son unha liña celular de hepatoma humano que se usa habitualmente como modelo de captación de hepatocitos in vitro. Aquí, as células HepG2 utilizáronse para avaliar a captación celular de nanopartículas deshidratadas mediante métodos de liofilización e secado por pulverización. Captación celular mediante dixitalización láser confocal mediante citometría de fluxo e visión despois de varias horas de incubación con insulina FITC libre a unha concentración de 25 μg/mL, nanopartículas cargadas con insulina FITC recentemente preparadas e nanopartículas cargadas con insulina FITC deshidratadas a concentracións iguais de insulina. Realizáronse observacións de microscopía cuantitativa (CLSM). As nanopartículas liofilizadas sen manitol foron destruídas durante a deshidratación e non se avaliaron nesta proba. As intensidades de fluorescencia intracelular de nanopartículas cargadas con insulina recentemente preparadas, nanopartículas liofilizadas con manitol e nanopartículas secadas por pulverización con e sen manitol (Fig. 6a) foron de 4,3, 2,6, 2,4, e 4,1 veces maiores que as libres. Grupo de insulina FITC, respectivamente (Fig. 6b). Estes resultados suxiren que a insulina encapsulada é máis potente na absorción celular que a insulina libre, principalmente debido ao menor tamaño das nanopartículas cargadas de insulina producidas no estudo.
Captación de células HepG2 despois de 4 h de incubación con nanopartículas recentemente preparadas e nanopartículas deshidratadas: (a) Distribución da captación de insulina FITC por células HepG2. (b) Media xeométrica das intensidades de fluorescencia analizadas por citometría de fluxo (n = 3), *P < 0,05 en comparación coa insulina libre.
Do mesmo xeito, as imaxes CLSM mostraron que as intensidades de fluorescencia FITC das nanopartículas cargadas con insulina FITC recentemente preparadas e das nanopartículas secadas por pulverización cargadas con insulina FITC (sen manitol) eran moito máis fortes que as das outras mostras (Fig. 6a). Ademais, coa adición de manitol, a maior viscosidade da solución aumentou a resistencia á absorción celular, o que resultou nunha diminución da proliferación da insulina. Estes resultados suxiren que as nanopartículas secadas por pulverización sen manitol mostraron a maior eficiencia de absorción celular porque o seu tamaño de partícula era menor que o das nanopartículas liofilizadas despois da redisolución.
A quitosana (peso molecular medio de 100 kDa, 75–85 % desacetilada) adquiriuse a Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canadá). O tripolifosfato de sodio (TPP) adquiriuse a VWR (Radnor, Pensilvania, EUA). A insulina humana recombinante empregada neste estudo foi de Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA). A insulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) e o diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) adquiriuse a Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canadá). A liña celular HepG2 obtívose de ATCC (Manassas, Virxinia, EUA). Todos os demais reactivos eran de grao analítico ou cromatográfico.
Prepare unha solución de CS de 1 mg/ml disolvéndoa en auga bidestilada (auga DD) que conteña ácido acético ao 0,1 %. Prepare solucións de TPP e insulina de 1 mg/ml disolvéndoas en auga DD e ácido acético ao 0,1 %, respectivamente. A preemulsión preparouse cun homoxenizador de alta velocidade Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, EUA). O proceso de preparación é o seguinte: primeiro, engádense 2 ml de solución de TPP a 4 ml de solución de insulina e a mestura axítase durante 30 minutos e mestúrase completamente. Despois, a solución mesturada engadiuse gota a gota á solución de CS a través dunha xiringa con axitación a alta velocidade (10.000 rpm). As mesturas mantivéronse con axitación a alta velocidade (15.000 rpm) nun baño de xeo durante 30 minutos e axustáronse a un determinado pH para obter nanopartículas de insulina reticuladas. Para homoxeneizar e reducir aínda máis o tamaño das partículas das nanopartículas de insulina, sonicáronse para 30 minutos adicionais nun baño de xeo usando un sonicador de tipo sonda (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Alemaña).
As novas nanopartículas de insulina (NSP) analizáronse para determinar o diámetro medio Z, o índice de polidispersidade (PDI) e o potencial zeta mediante medicións de dispersión dinámica da luz (DLS) cun Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) diluíndoas en auga DD a 25 °C. A morfoloxía e a distribución de tamaño caracterizáronse mediante un microscopio electrónico de transmisión (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Toquio, Xapón) e as imaxes analizáronse posteriormente mediante o software de imaxes Hitachi (Hitachi, Toquio, Xapón). Para avaliar a eficiencia de encapsulación (EE) e a capacidade de carga (LC) das nanopartículas de insulina, estas pipeteáronse en tubos de ultrafiltración cun límite de peso molecular de 100 kDa e centrifugáronse a 500 xg durante 30 min. A insulina non encapsulada no filtrado cuantificouse mediante un sistema HPLC Agilent serie 1100 (Agilent, Santa Clara, California, EUA) que consta dunha bomba cuaternaria, un automostrador, un quentador de columna, e detector DAD. A insulina analizouse cunha columna C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, EUA) e detectouse a 214 nm. A fase móbil foi acetonitrilo e auga, que contiña 0,1 % de TFA, con proporcións de gradiente de 10/90 a 100/0, e funcionou durante 10 minutos. A fase móbil bombeouse a un caudal de 1,0 ml/min. A temperatura da columna axustouse a 20 °C. Calcule as porcentaxes de EE e LC usando as ecuacións (1) e (2).
Probáronse varias proporcións de CS/insulina que oscilaban entre 2,0 e 4,0 para optimizar as nanopartículas de insulina. Engadíronse diferentes cantidades de solución de CS durante a preparación, mentres que a mestura de insulina/TPP se mantiña constante. As nanopartículas de insulina preparáronse no rango de pH de 4,0 a 6,5 ​​controlando coidadosamente o pH da mestura despois de engadir todas as solucións (insulina, TPP e CS). O EE e o tamaño das partículas das nanopartículas de insulina avaliáronse a diferentes valores de pH e proporcións de masa de CS/insulina para optimizar a formación de nanopartículas de insulina.
As nanopartículas de insulina optimizadas colocáronse no recipiente de aluminio e cubríronse con papel de seda axustado con cinta adhesiva. Posteriormente, os recipientes roscados colocáronse nun liofilizador Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, EUA) equipado cun secador de bandexa. A temperatura e a presión de baleiro axustáronse a -10 °C e 0,350 Torr durante as primeiras 2 horas e a 0 °C e 0,120 Torr durante as 22 horas restantes das 24 horas para obter nanopartículas de insulina secas.
Empregouse o secador por pulverización Buchi Mini B-290 (BÜCHI, Flawil, Suíza) para xerar insulina encapsulada. Os parámetros de secado seleccionados foron: temperatura 100 °C, fluxo de alimentación 3 L/min e fluxo de gas 4 L/min.
As nanopartículas de insulina antes e despois da deshidratación caracterizáronse mediante espectroscopia FTIR-ATR. As nanopartículas deshidratadas, así como a insulina libre e o quitosano, analizáronse cun espectrofotómetro FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA) equipado cun accesorio de mostraxe ATR universal (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA). As medias de sinal obtivéronse de 16 exploracións cunha resolución de 4 cm2 no rango de frecuencia de 4000-600 cm2.
A morfoloxía das nanopartículas de insulina secas avaliouse mediante imaxes SEM de nanopartículas de insulina liofilizadas e secadas por pulverización capturadas cun microscopio electrónico de varrido de feixe de ións enfocado Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregón, EUA). O principal parámetro empregado foi a voltaxe de 5 keV e a corrente de 30 mA.
Todas as nanopartículas de insulina deshidratadas foron redisoltas en auga dd. O tamaño das partículas, o PDI, o EE e o LC foron analizados de novo empregando o mesmo método mencionado anteriormente para avaliar a súa calidade despois da deshidratación. A estabilidade das nanopartículas de anhidroinsulina tamén se mediu probando as propiedades das nanopartículas despois dun almacenamento prolongado. Neste estudo, todas as nanopartículas despois da deshidratación almacenáronse no frigorífico durante tres meses. Despois de tres meses de almacenamento, analizáronse as nanopartículas para determinar o tamaño morfolóxico das partículas, o PDI, o EE e o LC.
Disolver 5 mL de nanopartículas reconstituídas en 45 mL que conteñan fluído gástrico simulado (pH 1,2, con 1 % de pepsina), fluído intestinal (pH 6,8, con 1 % de tripsina) ou solución de quimotripsina (100 g/mL, en tampón fosfato, pH 7,8) para avaliar a eficacia da insulina na protección das nanopartículas despois da deshidratación. Incubáronse a 37 °C cunha velocidade de axitación de 100 rpm. Recolléronse 500 μL da solución en diferentes momentos e determinouse a concentración de insulina mediante HPLC.
O comportamento de liberación in vitro de nanopartículas de insulina recentemente preparadas e deshidratadas probouse mediante o método da bolsa de diálise (límite de peso molecular de 100 kDa, Spectra Por Inc.). As nanopartículas secas recentemente preparadas e reconstituídas dializáronse en fluídos a pH 2,5, pH 6,6 e pH 7,0 (solución salina tamponada con fosfato 0,1 M, PBS) para simular o ambiente de pH do estómago, duodeno e parte superior do intestino delgado, respectivamente. Todas as mostras incubáronse a 37 °C con axitación continua a 200 rpm. Aspire o fluído fóra da bolsa de diálise de 5 mL nos seguintes tempos: 0,5, 1, 2, 3, 4 e 6 h e repón inmediatamente o volume con dializado fresco. A contaminación por insulina no fluído analizouse mediante HPLC e a taxa de liberación de insulina das nanopartículas calculouse a partir da proporción de insulina libre liberada e insulina total encapsulada nas nanopartículas (Ecuación 3).
As células da liña celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 cultiváronse en placas de 60 mm de diámetro empregando o medio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) que contiña un 10 % de soro fetal bovino, 100 UI/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina29. Os cultivos mantivéronse a 37 °C, 95 % de humidade relativa e 5 % de CO2. Para os ensaios de captación, as células HepG2 sementáronse a 1 × 105 células/ml nun sistema de portaobxectos de cámara Nunc Lab-Tek de 8 pozos (Thermo Fisher, NY, EUA). Para os ensaios de citotoxicidade, sementáronse en placas de 96 pozos (Corning, NY, EUA) a unha densidade de 5 × 104 células/ml.
O ensaio MTT utilizouse para avaliar a citotoxicidade de nanopartículas de insulina recentemente preparadas e deshidratadas30. As células HepG2 sementáronse en placas de 96 pozos cunha densidade de 5 × 104 células/ml e cultiváronse durante 7 días antes da proba. As nanopartículas de insulina diluíronse a varias concentracións (de 50 a 500 μg/ml) en medio de cultivo e despois administráronse ás células. Despois de 24 horas de incubación, as células laváronse 3 veces con PBS e incubáronse cun medio que contiña 0,5 mg/ml de MTT durante 4 horas adicionais. A citotoxicidade avaliouse medindo a redución encimática de MTT de tetrazolio amarelo a formazán púrpura a 570 nm usando un lector de placas espectrofotómetro Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Suíza).
A eficiencia de captación celular das nanopartículas comprobouse mediante microscopía confocal de varrido láser e análise por citometría de fluxo. Cada pozo do sistema de portaobxectos de cámara Nunc Lab-Tek tratouse con insulina FITC libre, nanopartículas cargadas con insulina FITC e reconstituíronse 25 μg/mL de nanopartículas de insulina FITC deshidratadas á mesma concentración e incubáronse durante 4 horas. As células laváronse 3 veces con PBS e fixáronse con paraformaldehído ao 4 %. Os núcleos tinguíronse con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). A localización da insulina observouse usando un microscopio confocal de varrido láser/dous fotóns Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Toquio, Xapón). Para a análise por citometría de fluxo, engadíronse as mesmas concentracións de 10 μg/mL de insulina FITC libre, nanopartículas cargadas con insulina FITC e nanopartículas de insulina FITC deshidratadas resolubilizadas. Placas de 96 pozos sembradas con células HepG2 e incubadas durante 4 horas. Despois de 4 horas de incubación, as células retiráronse e laváronse 3 veces con FBS. Analizáronse 5 × 104 células por mostra cun citómetro de fluxo BD LSR II (BD, Franklin Lakes, Nova Jersey, Estados Unidos).
Todos os valores exprésanse como media ± desviación estándar. As comparacións entre todos os grupos avaliáronse mediante ANOVA unidireccional ou proba t con IBM SPSS Statistics 26 para Mac (IBM, Endicott, Nova York, EUA) e considerouse estatisticamente significativo un valor de p < 0,05.
Este estudo demostra a flexibilidade e a capacidade da secado por pulverización para deshidratar nanopartículas de quitosano/TPP/insulina reticuladas cunha mellor reconstitución en comparación cos métodos estándar de liofilización que empregan axentes de volume ou crioprotectores, cunha maior capacidade de carga. As nanopartículas de insulina optimizadas produciron un tamaño medio de partícula de 318 nm e unha eficiencia de encapsulación do 99,4 %. Os resultados de SEM e FTIR despois da deshidratación mostraron que a estrutura esférica só se mantivo en nanopartículas secadas por pulverización con e sen manitol e liofilizadas con manitol, pero as nanopartículas liofilizadas sen manitol descompuxéronse durante a deshidratación. Na proba de capacidade de reconstitución, as nanopartículas de insulina secadas por pulverización sen manitol mostraron o tamaño medio de partícula máis pequeno e a maior carga tras a reconstitución. Os comportamentos de liberación de todas estas nanopartículas deshidratadas mostraron que se liberaron rapidamente en solucións de pH = 2,5 e pH = 7, e moi estables en solución de pH = 6,5. En comparación con outras nanopartículas deshidratadas redisoltas, as nanopartículas As nanopartículas de insulina secas preparadas mediante secado por pulverización sen manitol mostraron a liberación máis rápida. Este resultado é consistente co observado no ensaio de captación celular, xa que as nanopartículas secadas por pulverización en ausencia de manitol mantiveron case por completo a eficiencia de captación celular das nanopartículas recentemente preparadas. Estes resultados suxiren que as nanopartículas de insulina secas preparadas mediante secado por pulverización sen manitol son máis axeitadas para o seu posterior procesamento noutras formas de dosificación anhidras, como comprimidos orais ou películas bioadhesivas.
Debido a cuestións de propiedade intelectual, os conxuntos de datos xerados e/ou analizados durante o presente estudo non están dispoñibles publicamente, pero están dispoñibles a través dos respectivos autores previa solicitude razoable.
Kagan, A. Diabetes tipo 2: orixes sociais e científicas, complicacións médicas e implicacións para os pacientes e outras persoas (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. e Jiang, P. O desenvolvemento da encapsulación de insulina: é agora posible a administración oral? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. e Dass, CR. Avances recentes nos sistemas orais de administración de liposomas cargados con insulina para o tratamento da diabetes. Interpretación. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).