Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter mellores resultados, recomendámosche que uses unha versión máis recente do teu navegador (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
O ácido propiónico (PPA) utilízase para estudar o papel da disfunción mitocondrial en trastornos do neurodesenvolvemento como o trastorno do espectro autista. Sábese que o PPA interrompe a bioxénese, o metabolismo e a renovación mitocondrial. Non obstante, os efectos do PPA na dinámica, a fisión e a fusión mitocondriais seguen sendo problemáticos debido á complexa natureza temporal destes mecanismos. Aquí, empregamos técnicas complementarias de imaxe cuantitativa para investigar como o PPA afecta a ultraestrutura, a morfoloxía e a dinámica mitocondrial en células SH-SY5Y de tipo neuronal. O PPA (5 mM) causou unha diminución significativa na área mitocondrial (p < 0,01), no diámetro e circunferencia de Feret (p < 0,05) e na área 2 (p < 0,01). A análise do localizador de eventos mitocondriais mostrou un aumento significativo (p < 0,05) nos eventos de fisión e fusión, mantendo así a integridade da rede mitocondrial en condicións de estrés. Ademais, a expresión de ARNm de cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) e OPA1 (p < 0,05) reduciuse significativamente. 01). Isto ilustra a remodelación da morfoloxía, a bioxénese e a dinámica mitocondrial para manter a función en condicións de estrés. Os nosos datos proporcionan nova información sobre os efectos do PPA na dinámica mitocondrial e destacan a utilidade das técnicas de imaxe para estudar os complexos mecanismos reguladores implicados nas respostas ao estrés mitocondrial.
As mitocondrias participan integrais nunha variedade de funcións celulares máis alá dos seus papeis típicos na produción de enerxía e a biosíntese. O metabolismo mitocondrial é un regulador clave da sinalización do calcio, a homeostase metabólica e redox, a sinalización inflamatoria, as modificacións epixenéticas, a proliferación celular, a diferenciación e a morte celular programada1. En particular, o metabolismo mitocondrial é fundamental para o desenvolvemento, a supervivencia e a función neuronais e está amplamente implicado en diversas manifestacións da neuropatoloxía2,3,4.
Durante a última década, o estado metabólico emerxeu como un regulador central da neuroxénese, a diferenciación, a maduración e a plasticidade5,6. Recentemente, a morfoloxía e a dinámica mitocondrial convertéronse en compoñentes particularmente importantes da mitose, un proceso dinámico que mantén un conxunto de mitocondrias sas dentro das células. A dinámica mitocondrial está regulada por complexas vías interdependentes que van desde a bioxénese e a bioenerxética mitocondrial ata a fisión, fusión, transporte e eliminación mitocondrial7,8. A interrupción de calquera destes mecanismos integradores prexudica o mantemento de redes mitocondriais sas e ten profundas consecuencias funcionais para o neurodesenvolvemento9,10. De feito, a desregulación da dinámica mitocondrial obsérvase en moitos trastornos psiquiátricos, neurodexenerativos e do neurodesenvolvemento, incluídos os trastornos do espectro autista (TEA)11,12.
O TEA é un trastorno do neurodesenvolvemento heteroxéneo cunha arquitectura xenética e epixenética complexa. A herdabilidade do TEA é indiscutible, pero a etioloxía molecular subxacente segue a ser pouco coñecida. A acumulación de datos de modelos preclínicos, estudos clínicos e conxuntos de datos moleculares multiómicos proporciona cada vez máis evidencias de disfunción mitocondrial no TEA13,14. Anteriormente realizamos unha proba de metilación do ADN a nivel xenómico nunha cohorte de pacientes con TEA e identificamos xenes metilados diferencialmente agrupados ao longo das vías metabólicas mitocondriais15. Posteriormente, informamos da metilación diferencial dos reguladores centrais da bioxénese e a dinámica mitocondrial, que estaba asociada cun aumento do número de copias do ADNmt e unha alteración do perfil metabólico urinario no TEA16. Os nosos datos proporcionan cada vez máis evidencias de que a dinámica e a homeostase mitocondriais desempeñan un papel central na fisiopatoloxía do TEA. Polo tanto, mellorar a comprensión mecanicista da relación entre a dinámica, a morfoloxía e a función mitocondriais é un obxectivo clave da investigación en curso sobre enfermidades neurolóxicas caracterizadas pola disfunción mitocondrial secundaria.
As técnicas moleculares úsanse a miúdo para estudar o papel de xenes específicos nas respostas ao estrés mitocondrial. Non obstante, esta abordaxe pode estar limitada pola natureza multifacética e temporal dos mecanismos de control mitótico. Ademais, a expresión diferencial dos xenes mitocondriais é un indicador indirecto dos cambios funcionais, especialmente porque normalmente só se analiza un número limitado de xenes. Polo tanto, propuxéronse métodos máis directos para estudar a función mitocondrial e a bioenerxética17. A morfoloxía mitocondrial está estreitamente relacionada coa dinámica mitocondrial. A forma, a conectividade e a estrutura mitocondriais son fundamentais para a produción de enerxía e a supervivencia mitocondrial e celular5,18. Ademais, os diversos compoñentes da mitose céntranse nos cambios na morfoloxía mitocondrial, que poden servir como puntos finais útiles da disfunción mitocondrial e proporcionar unha base para estudos mecanicistas posteriores.
A morfoloxía mitocondrial pódese observar directamente mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), o que permite un estudo detallado da ultraestrutura celular. A TEM visualiza directamente a morfoloxía, a forma e a estrutura das cristas mitocondriais coa resolución de mitocondrias individuais, en lugar de depender unicamente da transcrición xenética, a expresión de proteínas ou os parámetros funcionais mitocondriais nas poboacións celulares17,19,20. Ademais, a TEM facilita o estudo das interaccións entre as mitocondrias e outros orgánulos, como o retículo endoplasmático e os autofagosomas, que desempeñan papeis clave na función mitocondrial e a homeostase21,22. Polo tanto, isto fai que a TEM sexa un bo punto de partida para estudar a disfunción mitocondrial antes de centrarse en vías ou xenes específicos. A medida que a función mitocondrial se volve cada vez máis relevante para a neuropatoloxía, existe unha clara necesidade de poder estudar directa e cuantitativamente a morfoloxía e a dinámica mitocondrial en modelos neuronais in vitro.
Neste artigo, examinamos a dinámica mitocondrial nun modelo neuronal de disfunción mitocondrial no trastorno do espectro autista. Anteriormente, informamos sobre a metilación diferencial da propionil-CoA carboxilase beta (PCCB) no ASD15, unha subunidade do encima propionil-CoA carboxilase mitocondrial PCC. Sábese que a desregulación do PCC causa a acumulación tóxica de derivados do propionilo, incluído o ácido propiónico (PPA)23,24,25. Demostrouse que o PPA interrompe o metabolismo neuronal e altera o comportamento in vivo e é un modelo animal establecido para estudar os mecanismos de neurodesenvolvemento implicados no TEA26,27,28. Ademais, informouse de que o PPA interrompe o potencial da membrana mitocondrial, a bioxénese e a respiración in vitro e utilizouse amplamente para modelar a disfunción mitocondrial nas neuronas29,30. Non obstante, o impacto da disfunción mitocondrial inducida polo PPA na morfoloxía e a dinámica mitocondrial segue a ser pouco coñecido.
Este estudo emprega técnicas de imaxe complementarias para cuantificar os efectos do PPA na morfoloxía, dinámica e función mitocondrial nas células SH-SY5Y. En primeiro lugar, desenvolvemos un método TEM para visualizar os cambios na morfoloxía e ultraestrutura mitocondrial17,31,32. Dada a natureza dinámica das mitocondrias33, tamén empregamos a análise do localizador de eventos mitocondriais (MEL) para cuantificar os cambios no equilibrio entre os eventos de fisión e fusión, o número e o volume mitocondriais baixo estrés PPA. Finalmente, examinamos se a morfoloxía e a dinámica mitocondrial están asociadas a cambios na expresión de xenes implicados na bioxénese, a fisión e a fusión. En conxunto, os nosos datos ilustran o desafío de dilucidar a complexidade dos mecanismos que regulan a dinámica mitocondrial. Destacamos a utilidade do TEM no estudo da morfoloxía mitocondrial como un punto final converxente medible da mitose nas células SH-SY5Y. Ademais, destacamos que os datos TEM proporcionan a información máis rica cando se combinan con técnicas de imaxe que tamén capturan eventos dinámicos en resposta ao estrés metabólico. Unha caracterización máis profunda dos mecanismos reguladores moleculares que apoian a mitose das células neuronais pode proporcionar información importante sobre o compoñente mitocondrial do sistema nervioso e as enfermidades neurodexenerativas.
Para inducir o estrés mitocondrial, as células SH-SY5Y foron tratadas con PPA usando propionato de sodio (NaP) a 3 mM e 5 mM. Antes da TEM, as mostras foron sometidas a preparación crioxénica de mostras mediante conxelación a alta presión e conxelación (Fig. 1a). Desenvolvemos unha canle automatizada de análise de imaxes mitocondriais para medir oito parámetros morfolóxicos das poboacións mitocondriais en tres réplicas biolóxicas. Descubrimos que o tratamento con PPA cambiou significativamente catro parámetros: área 2, área, perímetro e diámetro de Feret (Fig. 1b-e). A área 2 diminuíu significativamente tanto co tratamento con PPA a 3 mM como co de 5 mM (p = 0,0183 e p = 0,002, respectivamente) (Fig. 1b), mentres que a área (p = 0,003), o perímetro (p = 0,0106) e o diámetro de Feret diminuíron significativamente. Houbo unha redución significativa (p = 0,0172) no grupo de tratamento con 5 mM en comparación co grupo de control (Fig. 1c-e). As reducións significativas na área e na circunferencia mostraron que as células tratadas con 5 mM de PPA tiñan mitocondrias máis pequenas e redondeadas, e que estas mitocondrias eran menos alongadas que as das células de control. Isto tamén é consistente cunha diminución significativa no diámetro de Feret, un parámetro independente que indica unha diminución na maior distancia entre os bordos das partículas. Observáronse cambios na ultraestrutura das cristas: as cristas volvéronse menos pronunciadas baixo a influencia do estrés do PPA (Fig. 1a, panel B). Non obstante, non todas as imaxes reflectiron claramente a ultraestrutura das cristas, polo que non se realizou unha análise cuantitativa destes cambios. Estes datos de TEM poden reflectir tres posibles escenarios: (1) o PPA potencia a fisión ou inhibe a fusión, facendo que as mitocondrias existentes se reduza de tamaño; (2) unha bioxénese mellorada crea novas mitocondrias máis pequenas ou (3) induce ambos os mecanismos simultaneamente. Aínda que estas condicións non se poden distinguir mediante TEM, cambios morfolóxicos significativos indican cambios na homeostase e na dinámica mitocondrial baixo o estrés do PPA. Posteriormente exploramos parámetros adicionais para caracterizar mellor estas dinámicas e os posibles mecanismos subxacentes a elas.
O ácido propiónico (PPA) remodela a morfoloxía mitocondrial. (a) Imaxes representativas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) que mostran que o tamaño das mitocondrias diminúe e as mitocondrias se fan máis pequenas e redondeadas co aumento do tratamento con PPA; 0 mM (non tratado), 3 mM e 5 mM, respectivamente. As frechas vermellas indican as mitocondrias. (b-e) As células SH-SY5Y tratadas con PPA durante 24 h preparáronse para TEM e os resultados analizáronse mediante Fiji/ImageJ. Catro dos oito parámetros mostraron diferenzas significativas entre as células de control (non tratadas, 0 mM de PPA) e as tratadas (3 mM e 5 mM de PPA). (b) Rexión 2, (c) Área, (d) Perímetro, (e) Diámetro de Feret. Utilizáronse análises unidireccionais da varianza (control fronte a tratamento) e a proba de comparación múltiple de Dunnett para determinar diferenzas significativas (p < 0,05). Os puntos de datos representan o valor mitocondrial medio para cada célula individual e as barras de erro representan a media ± SEM. Os datos mostrados representan n = 3, polo menos 24 células por réplica; analizáronse un total de 266 imaxes; * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01.
Para caracterizar mellor como a dinámica mitocondrial responde ao PPA, tinguímos as mitocondrias con éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) e empregamos microscopía de lapso de tempo e análise MEL para localizar e cuantificar as mitocondrias despois de 24 horas a 3 e 5 mM de PPA. Tratamento de eventos de fisión e fusión. (Fig. 2a). Despois da análise MEL, as mitocondrias analizáronse máis a fondo para cuantificar o número de estruturas mitocondriais e o seu volume medio. Observamos un pequeno pero significativo aumento no número de eventos de fisión que ocorreron a 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] en comparación coa fisión [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] e os eventos de fusión [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] e fusión [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] <0,05)] aumentaron significativamente a 5 mM en comparación co control (Fig. 3b). O número de mitocondrias aumentou significativamente tanto a 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] como a 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), mentres que o volume medio de cada estrutura mitocondrial permaneceu sen cambios (Fig. 3c). 3d). En conxunto, isto suxire que a remodelación da dinámica mitocondrial serve como unha resposta compensatoria que mantén con éxito a integridade da rede mitocondrial. O aumento no número de eventos de fisión a 3 mM de PPA suxire que o aumento no número de mitocondrias se debe en parte á fisión mitocondrial, pero dado que o volume mitocondrial medio permanece esencialmente sen cambios, non se pode descartar a bioxénese como unha resposta compensatoria adicional. Non obstante, estes datos son consistentes coas estruturas mitocondriais máis pequenas e redondas observadas por TEM e tamén demostran cambios significativos na dinámica mitocondrial inducida polo PPA.
O ácido propiónico (PPA) induce a remodelación mitocondrial dinámica para manter a integridade da rede. Cultiváronse células SH-SY5Y, tratáronse con PPA a 3 e 5 mM durante 24 horas e tinguíronse con TMRE e Hoechst 33342 seguido de análise MEL. (a) Imaxes representativas de microscopía de lapso de tempo que mostran proxeccións de cor e intensidade máxima binarizadas no tempo 2 (t2) para cada condición. As rexións seleccionadas indicadas en cada imaxe binaria mellóranse e móstranse en 3D en tres marcos temporais diferentes (t1-t3) para ilustrar a dinámica ao longo do tempo; os eventos de fusión están destacados en verde; os eventos de fisión están destacados en verde. Móstrase en vermello. (b) Número medio de eventos dinámicos por condición. (c) Número medio de estruturas mitocondriais por célula. (d) Volume medio (µm3) de cada estrutura mitocondrial por célula. Os datos mostrados son representativos de n = 15 células por grupo de tratamento. As barras de erro mostradas representan a media ± SEM, barra de escala = 10 μm, * p < 0,05.
O ácido propiónico (PPA) causa a supresión transcricional dos xenes asociados coa dinámica mitocondrial. As células SH-SY5Y foron tratadas con 3 e 5 mM de PPA durante 24 h. A cuantificación relativa dos xenes realizouse mediante RT-qPCR e normalizouse a B2M. Xenes da bioxénese mitocondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 e (d) NFE2L2. Xenes de fusión e fisión mitocondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 e (i) DRP1. As diferenzas significativas (p < 0,05) comprobáronse mediante ANOVA unidireccional (control fronte a tratamento) e a proba de comparación múltiple de Dunnett: * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01 e **** indica p < 0,0001. As barras representan a expresión media ± SEM. Os datos mostrados representan n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) e n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) réplicas biolóxicas.
Os datos das análises TEM e MEL conxuntamente indican que o PPA altera a morfoloxía e a dinámica mitocondrial. Non obstante, estas técnicas de imaxe non proporcionan información sobre os mecanismos subxacentes que impulsan estes procesos. Polo tanto, examinamos a expresión de ARNm de nove reguladores clave da dinámica mitocondrial, a bioxénese e a mitose en resposta ao tratamento con PPA. Cuantificamos o oncoxene do mieloma celular (cMYC), o factor respiratorio nuclear (NRF1), o factor de transcrición mitocondrial 1 (TFAM), o factor de transcrición similar a NFE2 BZIP (NFE2L2), a proteína similar a gastrina 2 (STOML2), a atrofia do nervio óptico 1 (OPA1), a mitofusina 1 (MFN1), a mitofusina 2 (MFN2) e a proteína relacionada coa dinamina 1 (DRP1) despois de 24 horas de tratamento con 3 mM e 5 mM de PPA. Observamos un tratamento con PPA de 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 e p < 0,0001, respectivamente) e 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) (Fig. 3a–c). A diminución da expresión do ARNm foi dependente da dose: a expresión de cMYC, NRF1 e TFAM diminuíu 5,7, 2,6 e 1,9 veces a 3 mM, respectivamente, e 11,2, 3 e 2,2 veces a 5 mM. En contraste, o xene da bioxénese redox central NFE2L2 non se alterou a ningunha concentración de PPA, aínda que se observou unha tendencia similar dependente da dose de diminución da expresión (Fig. 3d).
Tamén examinamos a expresión de xenes clásicos implicados na regulación da fisión e a fusión. Crese que STOML2 está implicado na fusión, a mitofaxia e a bioxénese, e a súa expresión reduciuse significativamente (p < 0,0001) en 3 mM (cambio de 2,4 veces) e 5 mM (cambio de 2,8 veces) de PPA (Fig. 1). 3d). De xeito similar, a expresión do xene de fusión OPA1 diminuíu a 3 mM (cambio de 1,6 veces) e 5 mM (cambio de 1,9 veces) de PPA (p = 0,006 e p = 0,0024, respectivamente) (Fig. 3f). Non obstante, non atopamos diferenzas significativas na expresión dos xenes de fusión MFN1, MFN2 ou o xene de fisión DRP1 baixo estrés PPA de 24 horas (Fig. 3g–i). Ademais, descubrimos que os niveis de catro proteínas de fusión e fisión (OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1) non cambiaron nas mesmas condicións (Fig. 4a-d). É importante ter en conta que estes datos reflicten un único punto no tempo e poden non reflectir cambios na expresión de proteínas ou nos niveis de actividade durante as primeiras etapas do estrés PPA. Non obstante, as reducións significativas na expresión de cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 e OPA1 indican unha desregulación transcricional significativa do metabolismo, a bioxénese e a dinámica mitocondrial. Ademais, estes datos destacan a utilidade das técnicas de imaxe para estudar directamente os cambios no estado final da función mitocondrial.
Os niveis de proteínas do factor de fusión e fisión non cambiaron despois do tratamento con ácido propiónico (PPA). As células SH-SY5Y tratáronse con PPA a 3 e 5 mM durante 24 h. Os niveis de proteína cuantificáronse mediante análise de Western blot e os niveis de expresión normalizáronse con respecto á proteína total. Móstranse a expresión media de proteínas e os Western blots representativos da proteína diana e total. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. As barras representan a media ± SEM e os datos mostrados son representativos de n = 3 réplicas biolóxicas. Realizáronse comparacións múltiples (p < 0,05) mediante análise de varianza unidireccional e proba de Dunnett. O xel e o blot orixinais móstranse na Figura S1.
A disfunción mitocondrial está asociada a enfermidades multisistémicas que van desde enfermidades metabólicas, cardiovasculares e musculares ata enfermidades neurolóxicas1,10. Moitas enfermidades neurodexenerativas e neurodexenerativas están asociadas á disfunción mitocondrial, o que destaca a importancia destes orgánulos ao longo da vida do cerebro. Estas enfermidades inclúen a enfermidade de Parkinson, a enfermidade de Alzheimer e o TEA3,4,18. Non obstante, o acceso ao tecido cerebral para estudar estas enfermidades é difícil, especialmente a nivel mecanicista, o que fai que os sistemas de modelos celulares sexan unha alternativa necesaria. Neste estudo, empregamos un sistema de modelos celulares con células SH-SY5Y tratadas con PPA para recapitular a disfunción mitocondrial observada nas enfermidades neuronais, especialmente nos trastornos do espectro autista. O uso deste modelo de PPA para estudar a dinámica mitocondrial nas neuronas pode proporcionar información sobre a etioloxía do TEA.
Exploramos a posibilidade de empregar a TEM para observar os cambios na morfoloxía mitocondrial. É importante ter en conta que a TEM debe empregarse correctamente para maximizar a súa eficacia. A preparación de crioespécimes permite unha mellor preservación das estruturas neuronais ao fixar simultaneamente os compoñentes celulares e reducir a formación de artefactos34. En consonancia con isto, observamos que as células SH-SY5Y de tipo neuronal tiñan orgánulos subcelulares intactos e mitocondrias alongadas (Fig. 1a). Isto destaca a utilidade das técnicas de preparación crioxénica para estudar a morfoloxía mitocondrial en modelos de células neuronais. Aínda que as medicións cuantitativas son fundamentais para a análise obxectiva dos datos de TEM, aínda non hai consenso sobre que parámetros específicos deben medirse para confirmar os cambios morfolóxicos mitocondriais. Baseándonos nun gran número de estudos que examinaron cuantitativamente a morfoloxía mitocondrial17,31,32, desenvolvemos unha canle automatizada de análise de imaxes mitocondriais que mide oito parámetros morfolóxicos, a saber: área, área2, relación de aspecto, perímetro, circularidade, grao, diámetro de Feret e redondez.
Entre elas, o PPA reduciu significativamente a área 2, a área, o perímetro e o diámetro de Feret (Fig. 1b–e). Isto mostrou que as mitocondrias se volveron máis pequenas e redondeadas, o que é consistente con estudos previos que mostran unha diminución da área mitocondrial despois de 72 horas de estrés mitocondrial inducido por PPA30. Estas características morfolóxicas poden indicar fisión mitocondrial, un proceso necesario para secuestrar os compoñentes danados da rede mitocondrial para promover a súa degradación a través da mitofaxia35,36,37. Por outra banda, a diminución do tamaño mitocondrial medio pode estar asociada a un aumento da bioxénese, o que resulta na formación de pequenas mitocondrias nacentes. O aumento da fisión ou bioxénese representa unha resposta compensatoria para manter a mitose contra o estrés mitocondrial. Non obstante, non se pode descartar a diminución do crecemento mitocondrial, a fusión deficiente ou outras condicións.
Aínda que as imaxes de alta resolución creadas por TEM permiten a determinación de características morfolóxicas a nivel de mitocondrias individuais, este método produce instantáneas bidimensionais nun único punto no tempo. Para estudar as respostas dinámicas ao estrés metabólico, tinguimos as mitocondrias con TMRE e empregamos microscopía de lapso de tempo con análise MEL, que permite a visualización 3D de alto rendemento dos cambios na rede mitocondrial ao longo do tempo33,38. Observamos cambios sutís pero significativos na dinámica mitocondrial baixo estrés PPA (Fig. 2). A 3 mM, o número de eventos de fisión aumentou significativamente, mentres que os eventos de fusión permaneceron igual que no control. Observouse un aumento no número de eventos tanto de fisión como de fusión a 5 mM de PPA, pero estes cambios foron aproximadamente proporcionais, o que suxire que a cinética de fisión e fusión alcanza o equilibrio a concentracións máis altas (Fig. 2b). O volume mitocondrial medio permaneceu sen cambios tanto a 3 como a 5 mM de PPA, o que indica que se preservou a integridade da rede mitocondrial (Fig. 2d). Isto reflicte a capacidade das redes mitocondriais dinámicas para responder a un estrés metabólico leve para manter eficazmente a homeostase sen causar fragmentación da rede. A 3 mM de PPA, o aumento da fisión é suficiente para promover a transición a un novo equilibrio, pero requírese unha remodelación cinética máis profunda en resposta ao estrés inducido por concentracións máis altas de PPA.
O número de mitocondrias aumentou en ambas concentracións de estrés de PPA, pero o volume mitocondrial medio non cambiou significativamente (Fig. 2c). Isto pode deberse a un aumento da bioxénese ou a un aumento da división; non obstante, en ausencia dunha diminución significativa no volume mitocondrial medio, é máis probable que a biosíntese aumente. Non obstante, os datos da Figura 2 apoian a existencia de dous mecanismos compensatorios: un aumento no número de eventos de fisión, consistente coa regulación positiva da fisión mitocondrial, e un aumento no número de eventos, consistente coa bioxénese mitocondrial. En última instancia, a compensación dinámica para o estrés leve pode consistir en procesos simultáneos que impliquen fisión, fusión, bioxénese e mitofaxia. Aínda que autores anteriores demostraron que o PPA mellora a mitose30,39 e a mitofaxia29, nós proporcionamos evidencias da remodelación da dinámica de fisión e fusión mitocondrial en resposta ao PPA. Estes datos confirman os cambios morfolóxicos observados por TEM e proporcionan máis información sobre os mecanismos asociados coa disfunción mitocondrial inducida por PPA.
Dado que nin as análises TEM nin as MEL proporcionaron evidencia directa dos mecanismos reguladores xénicos subxacentes aos cambios morfolóxicos observados, examinamos a expresión de ARN de xenes implicados no metabolismo, a bioxénese e a dinámica mitocondriais. O protooncoxene cMYC é un factor de transcrición implicado na regulación das mitocondrias, a glicólise, o metabolismo dos aminoácidos e os ácidos graxos40. Ademais, sábese que o cMYC regula a expresión de case 600 xenes mitocondriais implicados na transcrición, tradución e ensamblaxe complexa mitocondrial, incluíndo NRF1 e TFAM41. NRF1 e TFAM son dous reguladores centrais da mitose, que actúan augas abaixo de PGC-1α para activar a replicación do ADNmt. Esta vía actívase mediante a sinalización de AMPc e AMPK e é sensible ao gasto enerxético e ao estrés metabólico. Tamén examinamos NFE2L2, un regulador redox da bioxénese mitocondrial, para determinar se os efectos do PPA poderían estar mediados polo estrés oxidativo.
Aínda que a expresión de NFE2L2 permaneceu sen cambios, atopamos unha diminución consistente dependente da dose na expresión de cMYC, NRF1 e TFAM despois de 24 h de tratamento con 3 mM e 5 mM de PPA (Fig. 3a–c). A regulación á baixa da expresión de cMYC xa foi reportada previamente como resposta ao estrés mitocondrial42 e, pola contra, a regulación á baixa da expresión de cMYC pode causar disfunción mitocondrial ao remodelar o metabolismo mitocondrial, a conectividade de rede e a polarización da membrana43. Curiosamente, o cMYC tamén está implicado na regulación da fisión e fusión mitocondrial42,43 e sábese que aumenta a fosforilación de DRP1 e a localización mitocondrial durante a división celular44, así como media a remodelación morfolóxica mitocondrial nas células nai neuronais45. De feito, os fibroblastos deficientes en cMYC presentan un tamaño mitocondrial reducido, o que é consistente cos cambios inducidos polo estrés do PPA43. Estes datos ilustran unha relación interesante pero aínda pouco clara entre o cMYC e a dinámica mitocondrial, o que proporciona un obxectivo interesante para futuros estudos da remodelación inducida polo estrés do PPA.
A redución de NRF1 e TFAM é consistente co papel de cMYC como un importante activador transcricional. Estes datos tamén son consistentes con estudos previos en células de cancro de colon humano que mostran que o PPA reduciu a expresión do ARNm de NRF1 ás 22 horas, o que se asociou coa depleción de ATP e un aumento de ROS46. Estes autores tamén informaron de que a expresión de TFAM aumentou ás 8,5 horas pero volveu aos niveis basais ás 22 horas. Pola contra, Kim et al. (2019) demostraron que a expresión do ARNm de TFAM diminuíu significativamente despois de 4 horas de estrés por PPA en células SH-SY5Y; non obstante, despois de 72 horas, a expresión da proteína TFAM aumentou significativamente e o número de copias do ADNmt aumentou significativamente. Polo tanto, a diminución no número de xenes da bioxénese mitocondrial que observamos despois de 24 horas non exclúe a posibilidade de que o aumento no número de mitocondrias estea asociado coa activación da bioxénese en momentos máis temperáns. Estudos previos demostraron que o PPA regula positivamente o ARNm e a proteína de PGC-1α en células SH-SY5Y ás 4 horas e 30 minutos, mentres que o ácido propiónico mellora a bioxénese mitocondrial nos hepatocitos de vitela a través do PGC-1α ás 12 horas e 39 minutos. Curiosamente, o PGC-1α non só é un regulador transcricional directo de NRF1 e TFAM, senón que tamén se demostrou que regula a actividade de MFN2 e DRP1 mediante a regulación da fisión e a fusión47. En conxunto, isto destaca o estreito acoplamento dos mecanismos que regulan as respostas compensatorias mitocondriais inducidas polo PPA. Ademais, os nosos datos reflicten unha desregulación significativa da regulación transcricional da bioxénese e o metabolismo baixo estrés do PPA.
Os xenes STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1 están entre os reguladores centrais da fisión, fusión e dinámica mitocondrial37,48,49. Hai moitos outros xenes implicados na dinámica mitocondrial; porén, xa se descubriu que STOML2, OPA1 e MFN2 están metilados diferencialmente en cohortes de ASD16 e varios estudos independentes informaron de cambios nestes factores de transcrición en resposta ao estrés mitocondrial50,51.52. A expresión tanto de OPA1 como de STOML2 reduciuse significativamente co tratamento con PPA de 3 mM e 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 é un dos reguladores clásicos da fusión mitocondrial a través da interacción directa con MFN1 e 2 e desempeña un papel na remodelación das cristas e na morfoloxía mitocondrial53. O papel preciso de STOML2 na dinámica mitocondrial segue sen estar claro, pero as evidencias suxiren que desempeña un papel na fusión mitocondrial, a bioxénese e a mitofaxia.
STOML2 está implicado no mantemento do acoplamento respiratorio mitocondrial e na formación de complexos da cadea respiratoria54,55 e demostrouse que altera profundamente as características metabólicas das células cancerosas56. Os estudos demostraron que STOML2 promove o potencial da membrana mitocondrial e a bioxénese a través da interacción con BAN e cardiolipina 55, 57, 58. Ademais, estudos independentes demostraron que a interacción entre STOML2 e PINK1 regula a mitofaxia59,60. En particular, informouse de que STOML2 interactúa directamente con MFN2 e a estabiliza e tamén desempeña un papel importante na estabilización de isoformas longas de OPA1 ao inhibir a protease responsable da degradación de OPA153,61,62. A redución na expresión de STOML2 observada nas reaccións de PPA pode facer que estas proteínas de fusión sexan máis susceptibles á degradación a través de vías dependentes da ubiquitina e do proteasoma48. Aínda que o papel preciso de STOML2 e OPA1 na resposta dinámica ao PPA non está claro, a diminución da expresión destes xenes de fusión (Figura 3) pode perturbar o equilibrio entre a fisión e a fusión e levar a unha diminución do tamaño mitocondrial (Figura 3). 1).
Por outra banda, a expresión da proteína OPA1 permaneceu sen cambios despois de 24 h, mentres que os niveis de ARNm e proteína de MFN1, MFN2 ou DRP1 non cambiaron significativamente despois do tratamento con PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Isto pode indicar que non hai cambios na regulación destes factores implicados na fusión e fisión mitocondrial. Non obstante, cómpre sinalar que cada un destes catro xenes tamén está regulado por modificacións postranscricionais (PTM) que controlan a actividade das proteínas. O OPA1 ten oito variantes de empalme alternativo que se clivan proteoliticamente nas mitocondrias para producir dúas isoformas distintas 63. O equilibrio entre as isoformas longas e curtas determina en última instancia o papel do OPA1 na fusión mitocondrial e no mantemento da rede mitocondrial 64. A actividade de DRP1 está regulada pola fosforilación da proteína quinase II dependente de calcio/calmodulina (CaMKII), mentres que a degradación de DRP1 está regulada pola ubiquitinación e a SUMOilación 65. Finalmente, tanto DRP1 como MFN1/2 son GTPases, polo que a actividade pode estar influenciada pola taxa de produción de GTP nas mitocondrias 66. Polo tanto, aínda que a expresión destas proteínas permaneza constante, isto pode non reflectir a actividade ou localización das proteínas inalteradas 67,68. De feito, os repertorios de proteínas PTM existentes adoitan servir como a primeira liña de defensa responsable da mediación das respostas agudas ao estrés. En presenza dun estrés metabólico moderado no noso modelo, é probable que o PTM promova unha maior actividade das proteínas de fusión e fisión para restaurar suficientemente a integridade mitocondrial sen requirir a activación adicional destes xenes a nivel de ARNm ou proteína.
En conxunto, os datos anteriores destacan a regulación complexa e dependente do tempo da morfoloxía mitocondrial e os desafíos de elucidar estes mecanismos. Para estudar a expresión xénica, primeiro é necesario identificar xenes diana específicos na vía. Non obstante, os nosos datos mostran que os xenes da mesma vía non responden do mesmo xeito ao mesmo estrés. De feito, estudos previos demostraron que diferentes xenes da mesma vía poden exhibir diferentes perfís de resposta temporal30,46. Ademais, existen mecanismos postranscricionais complexos que interrompen a relación entre a transcrición e a función xénica. Os estudos proteómicos poden proporcionar información sobre o impacto dos PTM e a función das proteínas, pero tamén supoñen desafíos, incluíndo métodos de baixo rendemento, altas relacións sinal-ruído e mala resolución.
Neste contexto, o estudo da morfoloxía mitocondrial mediante TEM e MEL ten un gran potencial para abordar cuestións fundamentais sobre a relación entre a dinámica e a función mitocondrial e como isto inflúe nas enfermidades. O máis importante é que a TEM proporciona un método directo para medir a morfoloxía mitocondrial como un punto final converxente da disfunción e a dinámica mitocondrial51. A MEL tamén proporciona un método directo para visualizar eventos de fisión e fusión nun ambiente celular tridimensional, o que permite a cuantificación da remodelación mitocondrial dinámica mesmo en ausencia de cambios na expresión xénica33. Aquí destacamos a utilidade das técnicas de imaxe mitocondrial nas enfermidades mitocondriais secundarias. Estas enfermidades caracterízanse normalmente por un estrés metabólico leve crónico caracterizado por unha remodelación sutil das redes mitocondriais en lugar dun dano mitocondrial agudo. Non obstante, a compensación mitocondrial necesaria para manter a mitose baixo estrés crónico ten profundas consecuencias funcionais. No contexto da neurociencia, unha mellor comprensión destes mecanismos compensatorios pode proporcionar información importante sobre a neuropatoloxía pleiotrópica asociada á disfunción mitocondrial.
En definitiva, os nosos datos destacan a utilidade das técnicas de imaxe para comprender as consecuencias funcionais das complexas interaccións entre a expresión xénica, as modificacións das proteínas e a actividade proteica que controlan a dinámica mitocondrial neuronal. Empregamos o PPA para modelar a disfunción mitocondrial nun modelo de célula neuronal para obter información sobre o compoñente mitocondrial do TEA. As células SH-SY5Y tratadas con PPA mostraron cambios na morfoloxía mitocondrial: as mitocondrias volvéronse pequenas e redondas, e as cristas estaban mal definidas cando se observaron mediante TEM. A análise MEL mostra que estes cambios ocorren concomitantemente cun aumento dos eventos de fisión e fusión para manter a rede mitocondrial en resposta a un estrés metabólico leve. Ademais, o PPA interrompe significativamente a regulación transcricional do metabolismo e a homeostase mitocondrial. Identificamos cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 e OPA1 como reguladores mitocondriais clave interrompidos polo estrés do PPA e que poden desempeñar un papel na mediación dos cambios inducidos polo PPA na morfoloxía e a función mitocondrial. Son necesarios estudos futuros para caracterizar mellor os cambios temporais inducidos polo PPA na expresión xénica e na actividade proteica, localización e modificacións postraducionais. Os nosos datos destacan a complexidade e a interdependencia dos mecanismos reguladores que median a resposta ao estrés mitocondrial e demostran a utilidade da TEM e outras técnicas de imaxe para estudos mecanicistas máis específicos.
A liña celular SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) adquiriuse a Sigma-Aldrich. As células SH-SY5Y cultiváronse en medio de Eagle modificado por Dulbecco/mestura de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) e L-glutamina (SC09411, ScienCell) en frascos de 25 cm2 suplementados con soro fetal bovino (FBS) ao 20 % (10493106, ThermoFisher Scientific) e penicilina-estreptomicina ao 1 % (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) a 37 °C e CO2 ao 5 %. As células subcultiváronse ata unha confluencia do 80 % usando tripsina-EDTA ao 0,05 % (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugáronse a 300 g e plantáronse a unha densidade de aproximadamente 7 × 105 células/ml. Todos os experimentos realizáronse en células SH-SY5Y indiferenciadas entre as pasaxes 19 e 22. O PPA adminístrase como NaP. Disolver o po de NaP (nº CAS 137-40-6, fórmula química C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) en auga morna MilliQ ata unha concentración de 1 M e almacenar a 4 °C. O día do tratamento, diluír esta solución con PPA 1 M ata 3 mM e 5 mM de PPA en medio sen soro (DMEM/F-12 con L-glutamina). As concentracións de tratamento para todos os experimentos foron sen PPA (0 mM, control), 3 mM e 5 mM de PPA. Os experimentos realizáronse en polo menos tres réplicas biolóxicas.
As células SH-SY5Y sementáronse en frascos de 25 cm5 a unha velocidade de 5,5 × 105 células/ml e cultiváronse durante 24 horas. O tratamento con PPA engadiuse ao frasco antes das 24 horas de incubación. Recoller os sedimentos celulares seguindo os protocolos normais de subcultivo de tecidos mamíferos (descritos anteriormente). Resuspender o sedimento celular en 100 µl de glutaraldehído ao 2,5 %, 1× PBS e almacenar a 4 °C ata o seu procesamento. As células SH-SY5Y centrifugáronse brevemente para sedimentar as células e eliminar a solución de glutaraldehído ao 2,5 % e 1× PBS. Resuspender o sedimento nun xel de agarosa ao 4 % preparado en auga destilada (a proporción de volume de agarosa a sedimento é de 1:1). Os anacos de agarosa colocáronse en grellas sobre placas planas e revestiuse con 1-hexadeceno antes da conxelación a alta presión. As mostras conxeláronse en acetona seca ao 100 % a -90 °C durante 24 horas. Despois, a temperatura aumentouse a -80 °C e engadiuse unha solución de tetróxido de osmio ao 1 % e glutaraldehído ao 0,1 %. As mostras almacenáronse a -80 °C durante 24 horas. Despois disto, a temperatura aumentouse gradualmente ata a temperatura ambiente durante varios días: de –80 °C a –50 °C durante 24 horas, a –30 °C durante 24 horas, a –10 °C durante 24 horas e, finalmente, ata a temperatura ambiente.
Tras a preparación crioxénica, as mostras impregnáronse con resina e realizáronse seccións ultrafinas (∼100 nm) cun ultramicrotomo Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). As seccións tinguíronse con acetato de uranilo ao 2 % e citrato de chumbo. As mostras observáronse cun microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (anteriormente FEI), Eindhoven, Países Baixos) que funciona a 200 kV (transmisor Lab6) e unha cámara CCD Gatan (Gatan, Reino Unido) equipada cun filtro de enerxía Tridiem.
En cada réplica técnica, adquiríronse polo menos 24 imaxes de células individuais, para un total de 266 imaxes. Todas as imaxes analizáronse mediante a macro Rexión de Interese (ROI) e a macro Mitocondria. A macro mitocondrial baséase en métodos publicados17,31,32 e permite o procesamento por lotes semiautomatizado de imaxes TEM en Fiji/ImageJ69. En resumo: a imaxe invértese e invértese mediante a subtracción de fondo de bóla rodante (radio de 60 píxeles) e un filtro de paso de banda FFT (usando límites superior e inferior de 60 e 8 píxeles respectivamente) e supresión de liñas verticais cunha tolerancia de orientación do 5 %. A imaxe procesada afínase automaticamente mediante un algoritmo de entropía máxima e xérase unha máscara binaria. Extraéronse as rexións de imaxe asociadas a ROI seleccionadas manualmente en imaxes TEM en bruto, caracterizando as mitocondrias e excluíndo a membrana plasmática e outras rexións de alto contraste. Para cada ROI extraída, analizáronse partículas binarias maiores de 600 píxeles e medíronse a área das partículas, o perímetro, os eixes maior e menor, o diámetro de Feret, a redondez e a circularidade empregando as funcións de medición integradas de Fiji/ImageJ. Seguindo a Merrill, Flippo e Strack (2017), calculáronse a área 2, a relación de aspecto das partículas (relación entre os eixes maior e menor) e o factor de forma (FF) a partir destes datos, onde FF = perímetro 2/4pi x área. A definición da fórmula paramétrica pódese atopar en Merrill, Flippo e Strack (2017). As macros mencionadas están dispoñibles en GitHub (véxase a Declaración de dispoñibilidade de datos). De media, analizáronse aproximadamente 5600 partículas por tratamento PPA, para un total de aproximadamente 17 000 partículas (datos non mostrados).
As células SH-SH5Y colocáronse en placas de cultivo de 8 cámaras (ThermoFisher, #155411) para permitir a adhesión durante a noite e despois incubáronse con TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) e Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). As imaxes adquiriuse mediante láseres de 405 nm e 561 nm nun ambiente de 10 minutos, e as imaxes en bruto adquiriuse como pilas z que contiñan 10 micrografías de imaxe cun paso az de 0,2 μm entre fotogramas de imaxe en 12 puntos de tempo posteriores. As imaxes recolléronse usando unha plataforma de superresolución Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemaña) usando unha lente LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. As imaxes analizáronse en ImageJ empregando unha canle descrita previamente e o complemento ImageJ para medir eventos de fusión e fisión, o número medio de estruturas mitocondriais e o volume mitocondrial medio por célula33. As macros MEL están dispoñibles en GitHub (consulte a Declaración de dispoñibilidade de datos).
As células SH-SY5Y cultiváronse en placas de seis pozos a unha densidade de 0,3 × 106 células/ml durante 24 horas antes do tratamento. O ARN extraeuse mediante o protocolo Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) con lixeiras modificacións: engadir 300 μl de tampón de lise de ARN a cada pozo antes da retirada e lisar cada mostra como paso final con 30 μl de elución de DNase/RNase. auga libre. Comprobouse a cantidade e a calidade de todas as mostras mediante un espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop ND-1000. A proteína total dos lisados ​​celulares obtívose utilizando 200 μl de tampón de lise RIPA e a concentración de proteínas cuantificouse mediante o ensaio de proteínas de Bradford70.
A síntese de ADNc realizouse empregando o kit de síntese de ADNc Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) segundo as instrucións do fabricante con algunhas modificacións. O ADNc sintetizouse en reaccións de 20 μl empregando de 0,7 a 1 μg de ARN total. Os cebadores seleccionáronse de artigos publicados previamente 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Táboa S1) e as sondas correspondentes deseñáronse empregando a ferramenta PrimerQuest de Integrated DNA Technologies. Todos os xenes de interese normalizáronse co xene nuclear B2M. A expresión xénica de STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC e OPA1 mediuse mediante RT-qPCR. A mestura mestra incluía LUNA Taq polimerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM de cebadores directos e inversos, ADNc e auga de grao PCR para obter un volume final de 10 μL para cada reacción. A expresión dos xenes de división e fisión (DRP1, MFN1/2) mediuse mediante ensaios multiplex TaqMan. A mestura mestra Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) utilizouse segundo as instrucións do fabricante con pequenas modificacións. A mestura mestra multiplex RT-qPCR inclúe 1X LUNA Taq polimerase, 10 μM de cebadores directos e inversos, 10 μM de sonda, ADNc e auga de grao PCR, o que resultou nun volume final de 20 μL para cada reacción. A RT-qPCR realizouse utilizando Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG; número de serie: R0618110). As condicións de ciclado móstranse na Táboa S1. Todas as mostras de ADNc amplificáronse por triplicado e xerouse unha curva estándar empregando unha serie de dilucións dez veces. Os valores atípicos en mostras por triplicado cunha desviación estándar do limiar do ciclo (Ct) >0,5 elimináronse da análise para garantir a reproducibilidade dos datos30,72. A expresión xénica relativa calculouse empregando o método 2-ΔΔCt79.
As mostras de proteínas (60 μg) mesturáronse con tampón de carga de Laemmli nunha proporción de 2:1 e executáronse nun xel de proteínas incoloro ao 12 % (Bio-Rad nº 1610184). As proteínas transferíronse a unha membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) (nº 170-84156, Bio-Rad) usando o sistema Trans-Blot Turbo (nº 170-4155, Bio-Rad). A membrana bloqueouse e incubouse cos anticorpos primarios axeitados (OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1) (diluídos 1:1000) durante 48 horas, seguido dunha incubación con anticorpos secundarios (1:10.000) durante 1 hora. Despois, as membranas foron fotografadas usando o substrato Clarity Western ECL (nº 170-5061, Bio-Rad) e rexistráronse usando un sistema Bio-Rad ChemiDoc MP. Para a análise de Western blot utilizouse ImageLab versión 6.1. O xel e a mancha orixinais móstranse na Figura S1. A información sobre os anticorpos ofrécese na Táboa S2.
Os conxuntos de datos preséntanse como a media e o erro estándar da media (SEM) de polo menos tres mostras independentes. Os conxuntos de datos comprobáronse para determinar a súa normalidade mediante a proba de Shapiro-Wilks (a non ser que se indique o contrario) antes de asumir unha distribución gaussiana e desviacións estándar iguais e continuar coas análises. Ademais, analizouse o conxunto de datos mediante a proba MEL LSD de Fisher (p < 0,05), a proba ANOVA unidireccional (media de tratamento fronte a media de control) e a proba de comparación múltiple de Dunnett para determinar a significación (p < 0,05). Os valores de p significativos móstranse no gráfico como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Todas as análises estatísticas e os gráficos realizáronse e xeráronse mediante GraphPad Prism 9.4.0.
As macros Fiji/ImageJ para a análise de imaxes TEM están dispoñibles publicamente en GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. A macro Localizador de eventos mitocondriais (MEL) está dispoñible publicamente en GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM e Vijaya A. Mitocondrias: reguladores principais do metabolismo, a homeostase, o estrés, o envellecemento e a epixenética. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Disfunción mitocondrial multifacética na esquizofrenia, complexo I como posible diana patolóxica. Esquizofrenia. recurso. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. e Beal, MF Disfunción mitocondrial na enfermidade de Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG e Mehta V. Mitocondrias estresadas: obxectivos de invasión na enfermidade de Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF e Ferreira GK. Mitocondrias e cerebro: bioenerxética e moito máis. Neurotoxinas. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitocondrias pleiotrópicas: o impacto das mitocondrias no desenvolvemento neuronal e as enfermidades. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. e Morais, VA Bioxénese mitocondrial en neuronas: como e onde. Internacionalidade. J. Mohr. A ciencia. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. e Zhao, J. Regulación da dinámica mitocondrial dos mamíferos: oportunidades e desafíos. front. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. e Slack, RS Dinámica mitocondrial na regulación da neuroxénese: desde o cerebro en desenvolvemento ata o adulto. Development. Dynamic. 247, 47–53 (2018).