Actualidade *Enderezo actual: Colonia 50931, Alemaña, Clúster de Excelencia de Colonia para a Investigación sobre a Resposta ao Estrés Celular en Enfermidades Relacionadas co Envellecemento (CECAD).
A neurodexeneración das enfermidades mitocondriais considérase irreversible porque a plasticidade metabólica das neuronas é limitada, pero o efecto da disfunción mitocondrial na autonomía celular do metabolismo neuronal no corpo non se coñece ben. Aquí, presentamos o proteoma específico de célula das neuronas de Purkinje con deficiencia progresiva de OXPHOS causada por unha dinámica de fusión mitocondrial interrompida. Descubrimos que a disfunción mitocondrial desencadeou un cambio profundo no campo da proteómica, que finalmente levou á activación secuencial de programas metabólicos precisos antes da morte celular. Inesperadamente, determinamos a indución obvia da piruvato carboxilase (PCx) e outros encimas antienvellecemento que complementan os intermediarios do ciclo TCA. A inhibición da PCx exacerbou o estrés oxidativo e a neurodexeneración, o que indica que a aterosclerose ten un efecto protector nas neuronas que carecen de OXPHOS. A restauración da fusión mitocondrial en neuronas dexeneradas terminalmente inverte completamente estas características metabólicas, evitando así a morte celular. Os nosos achados identifican vías previamente descoñecidas que confiren resiliencia á disfunción mitocondrial e mostran que a neurodexeneración pode reverterse mesmo nas etapas tardías da enfermidade.
O papel central das mitocondrias no mantemento do metabolismo enerxético neuronal vese enfatizado polos amplos síntomas neurolóxicos asociados ás enfermidades mitocondriais humanas. A maioría destas enfermidades son causadas por mutacións xenéticas que regulan a expresión xénica mitocondrial (1, 2) ou a destrución xénica relacionada coa dinámica mitocondrial, que afectan indirectamente á estabilidade do ADN mitocondrial (ADNmt) (3, 4). O traballo en modelos animais demostrou que, en resposta á disfunción mitocondrial nos tecidos circundantes, pódense activar vías metabólicas conservadoras (5-7), o que proporciona información importante para unha comprensión profunda da patoxénese destas enfermidades complexas. En contraste, a nosa comprensión dos cambios metabólicos de tipos celulares específicos causados ​​polo fallo xeral da produción de adenosina trifosfato (ATP) mitocondrial cerebral é fundamental (8), o que enfatiza a necesidade de identificar dianas terapéuticas que se poidan usar para previr ou previr enfermidades. Previr a neurodexeneración (9). A falta de información débese ao feito de que se considera amplamente que as células nerviosas teñen unha flexibilidade metabólica moi limitada en comparación cos tipos celulares dos tecidos circundantes (10). Dado que estas células desempeñan un papel central na coordinación do subministro de metabolitos ás neuronas para promover a transmisión sináptica e responder a lesións e enfermidades, a capacidade de adaptar o metabolismo celular ás complexas condicións do tecido cerebral está case limitada ás células gliais (11-14). Ademais, a heteroxeneidade celular inherente do tecido cerebral dificulta en gran medida o estudo dos cambios metabólicos que se producen en subgrupos neuronais específicos. Como resultado, sábese pouco sobre as consecuencias celulares e metabólicas exactas da disfunción mitocondrial nas neuronas.
Para comprender as consecuencias metabólicas da disfunción mitocondrial, illamos neuronas de Purkinje (PN) en diferentes estadios de neurodexeneración causada pola destrución da fusión da membrana externa mitocondrial (Mfn2). Aínda que as mutacións de Mfn2 en humanos están asociadas a unha forma de neuropatía sensorial motora hereditaria coñecida como Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), a destrución condicional de Mfn2 en ratos é un método de indución da disfunción da fosforilación oxidativa (OXPHOS) ben recoñecido. Os diversos subtipos neuronais (16-19) e o fenotipo neurodexenerativo resultante van acompañados de síntomas neurolóxicos progresivos, como trastornos do movemento (18, 19) ou ataxia cerebelosa (16). Mediante unha combinación de proteómica cuantitativa sen etiquetas (LFQ), metabolómica, imaxe e métodos virolóxicos, demostramos que a neurodexeneración progresiva induce fortemente a piruvato carboxilase (PCx) e outros factores implicados na arteriosclerose das PN in vivo. A expresión de encimas. Para verificar a relevancia deste achado, regulamos á baixa especificamente a expresión de PCx en PN con deficiencia de Mfn2, e descubrimos que esta operación agravaba o estrés oxidativo e aceleraba a neurodexeneración, o que demostra que a azoospermia confire morte celular. Adaptabilidade metabólica. A expresión severa de MFN2 pode rescatar completamente a PN de dexeneración terminal con deficiencia grave de OXPHOS, consumo masivo de ADN mitocondrial e rede mitocondrial aparentemente rota, o que subliña aínda máis que esta forma de neurodexeneración pode incluso recuperarse na fase avanzada da enfermidade antes da morte celular.
Para visualizar as mitocondrias nas neuronas neuronais (PN) con Mfn2 knockout, empregamos unha cepa de rato que permite que as mitocondrias dependentes de Cre se dirixan á expresión da proteína fluorescente amarela (YFP) (mtYFP) (20). Cre e comprobamos a morfoloxía mitocondrial in vivo. Descubrimos que a destrución do xene Mfn2 nas PN levaría á división gradual da rede mitocondrial (Figura S1A), e o cambio máis temperán atopouse ás 3 semanas de idade. En contraste, a dexeneración substancial da capa celular das PN, como evidencia a perda da inmunotinción de calbindina, non comezou ata as 12 semanas de idade (Figura 1, A e B). A discrepancia temporal entre os primeiros cambios na morfoloxía mitocondrial e o inicio visible da morte neuronal levounos a investigar os cambios metabólicos desencadeados pola disfunción mitocondrial antes da morte celular. Desenvolvemos unha estratexia baseada na clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para illar PN que expresan YFP (YFP+) (Figura 1C) e en ratos de control (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), en diante denominados CTRL (Figura S1B). A optimización da estratexia de activación baseada na intensidade relativa do sinal YFP permítenos purificar o corpo YFP+ (YFPhigh) das PN a partir de non-PN (YFPneg) (Figura S1B) ou putativos fragmentos axónicos/dendríticos fluorescentes (YFPlow; Figura S1D, esquerda), confirmado por microscopio confocal (Figura S1D, dereita). Para verificar a identidade da poboación clasificada, realizamos proteómica LFQ e despois análise de compoñentes principais, e descubrimos que hai unha clara separación entre as células YFPhigh e YFPneg (Figura S1C). As células YFPhigh mostraron un enriquecemento neto de marcadores de PN coñecidos (é dicir, Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), pero non enriquecemento de proteínas expresadas comunmente en neuronas ou outros tipos de células (Figura 1D)). Unha comparación entre mostras de células YFPhigh clasificadas recollidas en experimentos independentes mostrou un coeficiente de correlación > 0,9, o que demostra unha boa reproducibilidade entre réplicas biolóxicas (Figura S1E). En resumo, estes datos validaron o noso plan para o illamento agudo e específico de PN viable. Debido a que o sistema controlador L7-cre utilizado induce a recombinación en mosaico na primeira semana despois do parto (23), comezamos a sacrificar ratos de CTRL e condicionais (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Recollemos neuronas. Unha vez completada a recombinación, chámase Mfn2cKO ás 4 semanas de idade. Como punto final, escollemos as 8 semanas de idade cando a capa de PN estaba intacta a pesar da evidente fragmentación mitocondrial (Figura 1B e Figura S1A). En total, cuantificamos un total de 3013 proteínas, das cales arredor do 22 % se basearon en anotacións de MitoCarta 2.0 baseadas no proteoma mitocondrial como mitocondria (Figura 1E) (Figura 1E) (24). A análise da expresión xénica diferencial realizada na semana 8 mostrou que só o 10,5 % de todas as proteínas tiveron cambios significativos (Figura 1F e Figura S1F), das cales 195 proteínas estaban reguladas á baixa e 120 proteínas estaban reguladas á alza (Figura 1F). Cómpre sinalar que a «análise de vías innovadoras» deste conxunto de datos mostra que os xenes expresados ​​diferencialmente pertencen principalmente a un conxunto restrinxido de vías metabólicas específicas (Figura 1G). Curiosamente, aínda que a regulación á baixa das vías relacionadas con OXPHOS e a sinalización do calcio confirma a indución da disfunción mitocondrial nas PN con deficiencia de fusión, outras categorías que implican principalmente o metabolismo dos aminoácidos están significativamente reguladas á alza, o que está en liña co metabolismo que se produce nas PN mitocondriais. O recableado é consistente.
(A) Fotografías confocais representativas de seccións cerebelosas de ratos CTRL e Mfn2cKO que mostran a perda progresiva de PN (calbindina, gris); os núcleos foron contratinguídos con DAPI. (B) Cuantificación de (A) (análise unidireccional da varianza, ***P<0,001; n = 4 a 6 círculos de tres ratos). (C) Fluxo de traballo experimental. (D) Distribución do mapa de calor de marcadores específicos de Purkinje (arriba) e outros tipos de células (medio). (E) Diagrama de Venn que mostra o número de proteínas mitocondriais identificadas na PN clasificada. (F) Gráfico do volcán de proteínas expresadas diferencialmente en neuronas Mfn2cKO ás 8 semanas (valor de corte de significancia de 1,3). (G) A análise da vía da creatividade mostra as cinco vías de regulación ascendente (vermello) e de regulación descendente (azul) máis importantes na PN Mfn2cKO clasificada ás 8 semanas. Móstrase o nivel medio de expresión de cada proteína detectada. Mapa de calor en escala de grises: valor P axustado. ns, non importante.
Os datos proteómicos mostraron que a expresión proteica dos complexos I, III e IV diminuíu gradualmente. Os complexos I, III e IV contiñan todos subunidades esenciais codificadas por ADNmt, mentres que o complexo II, que só estaba codificado nuclearmente, basicamente non se viu afectado (Figura 2A e Figura S2A). De acordo cos resultados proteómicos, a inmunohistoquímica de seccións de tecido cerebeloso mostrou que o nivel da subunidade MTCO1 (subunidade 1 da citocromo C oxidase mitocondrial) do complexo IV na PN diminuíu gradualmente (Figura 2B). A subunidade Mtatp8 codificada por ADNmt reduciuse significativamente (Figura S2A), mentres que o nivel en estado estacionario da subunidade da ATP sintase codificada nuclearmente permaneceu sen cambios, o que é consistente co coñecido complexo F1 do subensamblaxe estable da ATP sintase cando a expresión do ADNmt é estable. A formación é consistente. Interrupción (7). A avaliación do nivel de ADNmt nas PN Mfn2cKO clasificadas mediante reacción en cadea da polimerase en tempo real (qPCR) confirmou a diminución gradual do número de copias de ADNmt. En comparación co grupo de control, ás 8 semanas de idade, só se retivo arredor do 20 % do nivel de ADNmt (Figura 2C). En consonancia con estes resultados, utilizouse a tinción de microscopía confocal das PN Mfn2cKO para detectar ADN, o que mostra o consumo de nucleótidos mitocondriais dependente do tempo (Figura 2D). Descubrimos que só algúns candidatos implicados na degradación de proteínas mitocondriais e na resposta ao estrés estaban regulados positivamente, incluíndo Lonp1, Afg3l2 e Clpx, e os factores de ensamblaxe do complexo OXPHOS. Non se detectaron cambios significativos nos niveis de proteínas implicadas na apoptose (Figura S2B). Do mesmo xeito, descubrimos que os canais mitocondriais e do retículo endoplasmático implicados no transporte de calcio só presentan cambios menores (Figura S2C). Ademais, a avaliación das proteínas relacionadas coa autofaxia non atopou cambios significativos, o que é consistente coa indución visible de autofagosomas observada in vivo por inmunohistoquímica e microscopía electrónica (Figura S3). Non obstante, a disfunción OXPHOS progresiva nas PN vai acompañada de cambios ultraestruturais mitocondriais evidentes. Pódense observar grupos mitocondriais nos corpos celulares e nas árbores dendríticas das PN Mfn2cKO de 5 e 8 semanas, e a estrutura da membrana interna sufriu cambios profundos (Figura S4, A e B). En consonancia con estes cambios ultraestruturais e unha diminución significativa do mtDNA, a análise de cortes cerebrais cerebelosos agudos con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) mostrou que o potencial da membrana mitocondrial nas PN Mfn2cKO diminuíu significativamente (Figura S4C).
(A) Análise do curso temporal do nivel de expresión do complexo OXPHOS. Considéranse só as proteínas con P<0,05 ás 8 semanas (ANOVA bidireccional). Liña punteada: Sen axuste en comparación con CTRL. (B) Esquerda: Un exemplo dunha sección cerebelosa marcada cun anticorpo anti-MTCO1 (barra de escala, 20 μm). A área ocupada polos corpos celulares de Purkinje está cuberta en amarelo. Dereita: Cuantificación dos niveis de MTCO1 (análise de varianza unidireccional; n = 7 a 20 células analizadas de tres ratos). (C) Análise qPCR do número de copias de ADNmt na PN ordenada (análise de varianza unidireccional; n = 3 a 7 ratos). (D) Esquerda: Un exemplo dunha porción cerebelosa marcada cun anticorpo anti-ADN (barra de escala, 20 μm). A área ocupada polos corpos celulares de Purkinje está cuberta en amarelo. Dereita: Cuantificación de lesións de ADNmt (análise de varianza unidireccional; n = 5 a 9 células de tres ratos). (E) Un exemplo dunha sección cerebelosa aguda que mostra células mitoYFP + Purkinje (frecha) nun rexistro de patch clamp de células enteiras. (F) Cuantificación da curva IV. (G) Rexistros representativos da inxección de corrente despolarizante en células de Purkinje CTRL e Mfn2cKO. Trazado superior: o primeiro pulso que desencadeou a PA. Trazado inferior: frecuencia máxima de PA. (H) Cuantificación das entradas espontáneas postsinápticas (sPSP). O trazado de rexistro representativo e a súa relación de zoom móstranse en (I). Análise unidireccional da varianza analizada de n = 5 a 20 células de tres ratos. Os datos exprésanse como media ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Trazos representativos de PA espontánea rexistrados usando o modo de patch clamp perforado. Trazado superior: frecuencia máxima de PA. Trazado inferior: zoom dun só PA. (K) Cuantificación da frecuencia media e máxima de PA segundo (J). Proba de Mann-Whitney; analizáronse n = 5 células de catro ratos. Os datos exprésanse como media ± SEM; non son importantes.
Detectouse un dano OXPHOS evidente na neurona neuronal Mfn2cKO de 8 semanas de idade, o que indica que a función fisiolóxica das neuronas é gravemente anormal. Polo tanto, analizamos as características eléctricas pasivas das neuronas con deficiencia de OXPHOS ás 4 a 5 semanas e ás 7 a 8 semanas realizando rexistros de patch clamp de células enteiras en cortes cerebelosos agudos (Figura 2E). Inesperadamente, o potencial medio de membrana en repouso e a resistencia de entrada das neuronas Mfn2cKO foron similares aos do control, aínda que houbo diferenzas sutís entre as células (Táboa 1). Do mesmo xeito, ás 4 a 5 semanas de idade, non se atoparon cambios significativos na relación corrente-voltaxe (curva IV) (Figura 2F). Non obstante, ningunha neurona Mfn2cKO de 7 a 8 semanas de idade sobreviviu ao réxime IV (paso de hiperpolarización), o que indica que existe unha clara sensibilidade ao potencial de hiperpolarización nesta fase tardía. En contraste, nas neuronas Mfn2cKO, as correntes despolarizantes que causan descargas de potencial de acción repetitiva (PA) son ben toleradas, o que indica que os seus patróns de descarga xerais non son significativamente diferentes dos das neuronas de control de 8 semanas de idade (Táboa 1 e Figura 2G). Do mesmo xeito, a frecuencia e a amplitude das correntes postsinápticas espontáneas (sPSC) foron comparables ás do grupo de control, e a frecuencia dos eventos aumentou de 4 semanas a 5 semanas a 7 semanas a 8 semanas cun aumento similar (Figura 2, H e I). O período de maduración sináptica nas PN (25). Obtivéronse resultados similares despois de parches perforados de PN. Esta configuración impide a posible compensación de defectos celulares de ATP, como podería ocorrer no rexistro de patch clamp de células enteiras. En particular, o potencial de membrana en repouso e a frecuencia de disparo espontáneo das neuronas Mfn2cKO non se viron afectados (Figura 2, J e K). En resumo, estes resultados indican que as PN con disfunción OXPHOS evidente poden facer fronte ben aos patróns de descarga de alta frecuencia, o que indica que existe un mecanismo de compensación que lles permite manter respostas electrofisiolóxicas case normais.
Os datos exprésanse como media ± SEM (análise da varianza unidireccional, proba de comparación múltiple de Holm-Sidak; *P < 0,05). O número da unidade indícase entre parénteses.
Propuxémonos investigar se algunha categoría do conxunto de datos proteómicos (Figura 1G) inclúe vías que poden contrarrestar a deficiencia grave de OXPHOS, o que explica por que a PN afectada pode manter unha electrofisioloxía case normal (Figura 2, E a K). A análise proteómica mostrou que os encimas implicados no catabolismo dos aminoácidos de cadea ramificada (BCAA) estaban significativamente regulados positivamente (Figura 3A e Figura S5A), e o produto final acetil-CoA (CoA) ou succinil CoA pode suplementar os tricarboxilatos no ciclo do ácido arteriosclerótico (TCA). Descubrimos que o contido de transaminase BCAA 1 (BCAT1) e BCAT2 aumentou. Catalizan o primeiro paso do catabolismo dos BCAA xerando glutamato a partir de α-cetoglutarato (26). Todas as subunidades que compoñen o complexo cetoácido deshidroxenase de cadea ramificada (BCKD) están reguladas positivamente (o complexo cataliza a descarboxilación posterior e irreversible do esqueleto de carbono BCAA resultante) (Figura 3A e Figura S5A). Non obstante, non se atoparon cambios evidentes nos propios BCAA nas PN clasificadas, o que pode deberse ao aumento da absorción celular destes aminoácidos esenciais ou ao uso doutras fontes (glicosa ou ácido láctico) para complementar o ciclo TCA (Figura S5B). As PN que carecen de OXPHOS tamén mostraron un aumento das actividades de descomposición e transaminación da glutamina ás 8 semanas de idade, o que pode reflectirse na regulación positiva dos encimas mitocondriais glutaminase (GLS) e glutamina piruvato transaminase 2 (GPT2) (Figura 3, A e C). Cómpre sinalar que a regulación á alza de GLS está limitada á isoforma empalmada da glutaminase C (GLS-GAC) (o cambio de Mfn2cKO/CTRL é de aproximadamente 4,5 veces, P = 0,05), e a súa regulación á alza específica nos tecidos cancerosos pode favorecer a bioenerxía mitocondrial. (27).
(A) O mapa de calor mostra o cambio de pregamento no nivel de proteína para a ruta especificada ás 8 semanas. (B) Exemplo dun corte cerebeloso marcado con anticorpo anti-PCx (barra de escala, 20 μm). A frecha amarela apunta ao corpo celular de Purkinje. (C) Análise da expresión de proteínas no curso do tempo identificada como un candidato importante para a aterosclerose (proba t múltiple, *FDR <5%; n = 3-5 ratos). (D) Arriba: Un diagrama esquemático que mostra as diferentes formas de entrar no carbono marcado contido no trazador [1-13C]piruvato (é dicir, a través de PDH ou ruta transarterial). Abaixo: O gráfico en forma de violín mostra a porcentaxe de carbono marcado individualmente (M1) convertido en ácido aspártico, ácido cítrico e ácido málico despois de marcar os cortes cerebelosos agudos con [1-13C]piruvato (proba t pareada; ** P <0,01). (E) Análise exhaustiva do historial temporal da ruta indicada. Considéranse só as proteínas con P<0,05 ás 8 semanas. Liña descontinua: sen valor de axuste (análise da varianza bidireccional; * P <0,05; *** P <0,001). Os datos exprésanse como media ± SEM.
Na nosa análise, o catabolismo dos BCAA converteuse nunha das vías clave de regulación á alza. Este feito suxire fortemente que o volume de ventilación que entra no ciclo do TCA pode cambiar nas PN con deficiencia de OXPHOS. Isto pode representar unha forma importante de recableado metabólico neuronal, que pode ter un impacto directo na fisioloxía neuronal e na supervivencia durante o mantemento dunha disfunción OXPHOS grave. En consonancia con esta hipótese, descubrimos que o principal encima antiaterosclerótico PCx está regulado á alza (Mfn2cKO/CTRL cambia aproximadamente 1,5 veces; Figura 3A), o que cataliza a conversión de piruvato en oxaloacetato (28), que se cre que se atopa no tecido cerebral. A expresión en está restrinxida aos astrocitos (29, 30). En consonancia cos resultados proteómicos, a microscopía confocal mostrou que a expresión de PCx aumentaba específica e significativamente nas PN con deficiencia de OXPHOS, mentres que a reactividade de PCx se restrinxía principalmente ás células gliais de Bergmann adxacentes do control (Figura 3B). Para probar funcionalmente a regulación á alza observada de PCx, tratamos cortes cerebelosos agudos cun trazador [1-13C]piruvato. Cando o piruvato foi oxidado pola piruvato deshidroxenase (PDH), a súa etiqueta isotópica desapareceu, pero incorpórase aos intermediarios do ciclo TCA cando o piruvato é metabolizado por reaccións vasculares (Figura 3D). En apoio dos nosos datos proteómicos, observamos un gran número de marcadores deste trazador no ácido aspártico dos cortes de Mfn2cKO, mentres que o ácido cítrico e o ácido málico tamén tiveron unha tendencia moderada, aínda que non significativa (Figura 3D).
Nas neuronas dopaminérxicas de ratos MitoPark con disfunción mitocondrial causada por neuronas dopaminérxicas que destrúen especificamente o xene do factor de transcrición mitocondrial A (Tfam) (Figura S6B), a expresión de PCx tamén se regulou positivamente de forma significativa (31), o que indica que a arteriosclerose do ácido acetánico. A aparición da enfermidade está regulada durante a disfunción do OXPHOS neuronal no corpo. Cómpre sinalar que se descubriu que os encimas únicos (32-34) que poden expresarse en neuronas que poden estar asociadas coa arteriosclerose están significativamente regulados positivamente en PN que carecen de OXPHOS, como a propionil-CoA carboxilase (PCC-A), o malonil-CoA converte o propionil-CoA en succinil-CoA e o encima málico mitocondrial 3 (ME3), cuxa función principal é recuperar o piruvato do malato (Figura 3, A e C) (33, 35). Ademais, atopamos un aumento significativo no encima Pdk3, que fosforila e, polo tanto, inactiva a PDH (36), mentres que non se detectaron cambios no encima Pdp1 que activa a PDH nin no propio complexo encimático da PDH (Figura 3A). De xeito consistente, nas PN Mern2cKO, a fosforilación da subunidade α1 α (PDHE1α) do compoñente E1 da piruvato deshidroxenase do complexo PDH en Ser293 (que se sabe que inhibe a actividade encimática da PDH) viuse mellorada (Figura S6C) (Figura S6C). O piruvato non ten acceso vascular.
Finalmente, descubrimos que a supervía da biosíntese de serina e glicina, o ciclo relacionado do folato mitocondrial (1C) e a biosíntese de prolina (Figura 1G e Figura S5C) están significativamente reguladas positivamente, segundo os informes, durante o proceso de activación. Os tecidos circundantes actívanse con disfunción mitocondrial (5-7). A análise confocal que apoia estes datos proteómicos mostrou que na PN con OXPHOS ausente, as rodajas cerebelosas de ratos de 8 semanas de idade foron sometidas a serina hidroximetiltransferase 2 (SHMT2), un encima clave do ciclo do folato mitocondrial. Resposta inmunitaria significativa (Figura S5D). En 13 rodajas cerebelosas agudas incubadas con CU-glicosa, os experimentos de trazado metabólico confirmaron aínda máis a regulación positiva da biosíntese de serina e prolina, o que indica que o fluxo de isoformas de carbono na serina e a prolina aumentou (Figura S5E). Dado que as reaccións promovidas por GLS e GPT2 son responsables da síntese de glutamato a partir de glutamina e da transaminación entre o glutamato e o α-cetoglutarato, a súa regulación á alza indica que as neuronas con deficiencia de OXPHOS teñen unha maior demanda de glutamato. Isto pode ter como obxectivo manter o aumento da biosíntese de prolina (Figura S5C). En contraste con estes cambios, unha análise proteómica de astrocitos cerebelosos de ratos Mfn2cKO específicos de PN mostrou que estas vías (incluíndo todas as antiperoxidasas) non cambiaron significativamente na expresión, o que demostra que esta redirección metabólica é selectiva para a PN degradada (Fig. S6, D a G).
En resumo, estas análises revelaron patróns significativamente diferentes de activación temporal de vías metabólicas específicas nas neuronas periféricas. Aínda que a función mitocondrial neuronal anormal pode levar a aterosclerose temperá e remodelación 1C (Figura 3E e Figura S5C), e mesmo a cambios predicibles na expresión dos complexos I e IV, os cambios na síntese de novo de serina só se fixeron evidentes nas últimas etapas. Disfunción OXPHOS (Figura 3E e Figura S5C). Estes achados definen un proceso secuencial no que a resposta mitocondrial (ciclo 1C) e citoplasmática (biosíntese de serina) inducida polo estrés responden sinérxicamente co aumento da aterosclerose no ciclo TCA para remodelar o metabolismo neuronal.
As PN de 8 semanas de idade con deficiencia de OXPHOS poden manter unha actividade de excitación de alta frecuencia e sufrir unha reconexión metabólica significativa para compensar a disfunción mitocondrial. Este descubrimento expón unha interesante posibilidade de que, mesmo neste momento, estas células tamén poidan recibir intervención terapéutica para atrasar ou previr a neurodexeneración tardíamente. Resolvemos esta posibilidade mediante dúas intervencións independentes. No primeiro método, deseñamos un vector de virus adenoasociado (AAV) dependente de Cre para que MFN2 poida expresarse selectivamente en PN con deficiencia de OXPHOS in vivo (Figura S7A). O AAV que codifica MFN2 e o xene reporteiro fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) verificáronse en cultivos neuronais primarios in vitro, o que provocou que MFN2 se expresase dun xeito dependente de Cre e rescatou a morfoloxía mitocondrial, evitando así a neuromutación nas neuronas Mfn2cKO (Figura S7, B, D e E). A continuación, realizamos experimentos in vivo para administrar estereotacticamente Mfn2-AAV de 8 semanas de idade ao córtex cerebeloso de ratos Mfn2cKO e de control, e analizamos ratos de 12 semanas de idade (Figura 4A). Os ratos Mfn2cKO tratados morreron (Figura 1, A e B) (16). A transdución viral in vivo resultou nunha expresión selectiva de PN nalgúns círculos cerebelosos (Figura S7, G e H). A inxección do AAV de control que expresaba só mCherry (Ctrl-AAV) non tivo un efecto significativo no grao de neurodexeneración en animais Mfn2cKO. En contraste, a análise de Mfn2cKO transducidos con Mfn2-AAV mostrou un efecto protector significativo da capa de células PN (Figura 4, B e C). En particular, a densidade neuronal parece ser case indistinguible da dos animais de control (Figura 4, B e C, e Figura S7, H e I). A expresión de MFN1 pero non de MFN2 é igualmente eficaz para salvar a morte neuronal (Figura 4C e Figura S7, C e F), o que indica que a expresión de MFN1 ectópico pode suplementar eficazmente a falta de MFN2. Unha análise posterior a nivel de neurona polimorfa única mostrou que o Mfn2-AAV rescatou en gran medida a ultraestrutura das mitocondrias, normalizou os niveis de ADNmt e reverteu a alta expresión do marcador antianxioxénese PCx ​​(Figura 4, C a E). A inspección visual dos ratos Mfn2cKO rescatados en estado de repouso mostrou que a súa postura e os seus síntomas motores (movemento S1 a S3) melloraron. En conclusión, estes experimentos mostran que a reintrodución tardía de MFN2 en neuronas polimorfas con deficiencias graves de OXPHOS é suficiente para reverter o consumo de ADNmt e inducir a aterosclerose, evitando así a dexeneración dos axóns e a morte neuronal in vivo.
(A) Un esquema que mostra o programa experimental para inxectar AAV que codifica MFN2 cando se activa a vía metabólica indicada. (B) Imaxes confocais representativas de cortes cerebelosos de 12 semanas de idade transducidos ás 8 semanas en ratos Mfn2cKO e marcados con anticorpo anti-Calbindina. Dereita: Escalado das fibras axónicas. A escala do zoom axónico é de 450 e 75 μm. (C) Esquerda: Cuantificación da densidade de células de Purkinje no bucle de transdución de AAV (AAV+) (análise unidireccional da varianza; n = 3 ratos). Dereita: análise de foco de ADNmt en PN transducida na semana 12 (proba t non pareada; n = 6 células de tres ratos). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografías electrónicas de transmisión representativas de PN de seccións cerebelosas de Mfn2cKO transducidas cos vectores virais indicados. A máscara rosa ilustra a área ocupada polas dendritas e o cadrado amarelo punteado ilustra o zoom proporcionado á dereita; n representa o núcleo. Barra de escala, 1 μm. (E) mostra un exemplo de tinguidura de PCx en PN transducida ás 12 semanas. Barra de escala, 20 μm. OE, sobreexpresión; FC, cambio de pregamento.
Finalmente, investigamos a importancia da supervivencia celular inducida por peroxidase en PN que experimentaron disfunción OXPHOS. Xeramos mCherry que codifica AAV-shRNA (ARN en forquita curta) dirixido especificamente ao ARNm de PCx de rato (AAV-shPCx) e inxectamos o virus ou o seu control codificado (AAV-scr) no cerebelo de ratos Mfn2cKO. A inxección realizouse na cuarta semana de idade (Figura 5A) para lograr unha inhibición efectiva de PCx durante o período no que a expresión de PCx aumentaba (Figura 3C) e a capa celular de PN seguía intacta (Figura 1A). Cómpre sinalar que a inhibición de PCx (Figura S8A) leva a unha aceleración significativa da morte de PN, que se limita ao anel infectado (Figura 5, B e C). Para comprender o mecanismo dos efectos metabólicos inducidos pola regulación positiva de PCx, estudamos o estado redox das neuronas periféricas (PN) despois da inactivación de PCx e da expresión simultanea do biosensor óptico Grx1-roGFP2 mediado por AAV (Figura S8, B a D) para avaliar o cambio relativo do potencial redox do péptido por glutatión (38). Despois, realizamos microscopía de imaxe de fluorescencia de dous fotóns durante toda a vida (FLIM) en cortes cerebrais agudos de Mfn2cKO de 7 semanas de idade ou de compañeiros de camada de control para detectar posibles cambios no estado redox citoplasmático despois de verificar as condicións FLIM (Figura S8, E a G). A análise mostrou un aumento significativo no estado de oxidación dunha soa PN de Mfn2cKO que carece de expresión de PCx, o que é diferente das neuronas de control ou das PN de Mfn2cKO que expresan só ARNm codificado (Figura 5, D e E). Cando a expresión de PCx foi regulada á baixa, a porcentaxe de neuronas nucleotídicas Mfn2cKO que mostraban un estado altamente oxidado aumentou máis de tres veces (Figura 5E), o que indica que a regulación á alza de PCx mantivo a capacidade redox das neuronas dexeneradas.
(A) Un esquema que mostra o programa experimental para inxectar AAV que codifica shPCx cando se activa a vía metabólica indicada. (B) Fotografías confocais representativas de seccións cerebelosas de 8 semanas de idade en ratos Mfn2cKO transducidos e marcados con anticorpo anti-calcineurina ás 4 semanas. Barra de escala, 450 μm. (C) Cuantificación da densidade de células de Purkinje en bucles transducidos por AAV (análise unidireccional da varianza; n = 3 a 4 ratos). Os datos exprésanse como media ± SEM; ***P < 0,001. (D) A imaxe FLIM representativa mostra a vida útil media do sensor redox de glutatión Grx1-roGFP2 que expresa PN de 7 semanas de idade nas condicións experimentais especificadas. Relación LUT (táboa de consulta): intervalo de tempo de supervivencia (en picosegundos). Barra de escala, 25 μm. (E) O histograma mostra a distribución dos valores de vida útil de Grx1-roGFP2 a partir de (D) (n=158 a 368 células en dous ratos en cada condición). O gráfico circular sobre cada histograma mostra o número de células con valores de vida útil significativamente máis longos (vermello, oxidado) ou máis curtos (azul, reducido), que superan 1 desviación estándar do valor medio de vida útil en CTRL-AAV-scr. (F) O modelo proposto mostra o efecto protector da regulación á alza da PCx neuronal.
En definitiva, os datos que proporcionamos aquí amosan que a reexpresión de MFN2 pode rescatar completamente a neurodexeneración avanzada con deficiencia grave de OXPHOS, depleción grave de ADNmt e morfoloxía extremadamente anormal de tipo ista, proporcionando así un progreso continuo mesmo en enfermidades avanzadas. A neurodexeneración proporciona evidencia reversible da etapa previa á morte celular. Este grao de flexibilidade metabólica vese aínda máis reforzado pola capacidade das neuronas para inducir a aterosclerose (un recableado do ciclo TCA), que inhibe a expresión de PCx nas neuronas que carecen de OXPHOS e potencia a morte celular, desempeñando así un papel protector (Figura 5F).
Neste estudo, proporcionamos evidencias de que a resposta das neuronas periféricas (NP) á disfunción OXPHOS é converxer gradualmente cara á aterosclerose do ciclo TCA a través da vía de activación diferencial activada por programas metabólicos. Confirmamos a análise proteómica con moitos métodos complementarios e revelamos que, cando se ven afectadas por unha disfunción mitocondrial grave, as neuronas teñen unha forma de elasticidade metabólica previamente descoñecida. Para a nosa sorpresa, todo o proceso de recableado non marca necesariamente o estado metabólico terminal que acompaña á neurodexeneración de forma gradual e irreversible, pero os nosos datos suxiren que pode constituír un mecanismo de compensación funcional para o mantemento das neuronas mesmo na etapa previa á morte celular. Este achado indica que as neuronas teñen un grao considerable de plasticidade metabólica no corpo. Este feito demostra que a posterior reintrodución de MFN2 pode reverter a expresión de marcadores metabólicos clave e previr a dexeneración das NP. Pola contra, inhibe a aterosclerose e acelera os nervios transexuales.
Un dos achados máis fascinantes da nosa investigación é que as neuronas periféricas (PN) que carecen de OXPHOS poden modificar o metabolismo do ciclo do TCA mediante a regulación positiva de encimas que estimulan especificamente a arteriosclerose. O rearranxo metabólico é unha característica común das células cancerosas, algunhas das cales dependen da glutamina para complementar os intermediarios do ciclo do TCA para producir equivalentes redutores, que impulsan a cadea respiratoria e manteñen a produción de precursores da biosíntese de lípidos e nucleótidos (39, 40). Un estudo recente mostrou que nos tecidos periféricos que experimentan disfunción OXPHOS, a reconexión do metabolismo da glutamina/glutamato tamén é unha característica destacada (5, 41), onde a dirección da entrada da glutamina no ciclo do TCA depende da gravidade da lesión por OXPHOS (41). Non obstante, non hai evidencia clara sobre calquera semellanza da plasticidade metabólica neuronal no corpo e a súa posible relevancia no contexto da enfermidade. Nun estudo recente in vitro, demostrouse que as neuronas corticais primarias mobilizan reservas de glutamato para a neurotransmisión, promovendo así o metabolismo oxidativo e a aterosclerose en condicións de estrés metabólico (42). Cómpre sinalar que, baixo a inhibición farmacolóxica do encima succinato deshidroxenase do ciclo TCA, crese que a carboxilación do piruvato mantén a síntese de oxaloacetato en neuronas granulares cerebelosas cultivadas (34). Non obstante, a relevancia fisiolóxica destes mecanismos para o tecido cerebral (onde se cre que a aterosclerose se limita principalmente aos astrocitos) aínda ten un importante significado fisiolóxico (43). Neste caso, os nosos datos mostran que as PN danadas por OXPHOS no corpo poden cambiar á degradación de BCAA e á carboxilación do piruvato, que son as dúas principais fontes de suplementación de intermediarios do conxunto de TCA. Aínda que se propuxo a suposta contribución do catabolismo de BCAA ao metabolismo enerxético neuronal, ademais do papel do glutamato e o GABA para a neurotransmisión (44), aínda non hai evidencia destes mecanismos in vivo. Polo tanto, é doado especular que as PN disfuncionais poden compensar automaticamente o consumo de intermediarios de TCA impulsados ​​polo proceso de asimilación mediante o aumento da aterosclerose. En particular, pode ser necesaria a regulación á alza da PCx para manter unha maior demanda de ácido aspártico, o que se suxire nas células proliferativas con disfunción mitocondrial (45). Non obstante, a nosa análise metabolómica non revelou ningún cambio significativo no nivel de ácido aspártico en estado estacionario nas neuronas periféricas Mfn2cKO (Figura S6A), o que presumiblemente reflicte a diferente utilización metabólica do ácido aspártico entre as células proliferativas e as neuronas posmitóticas. Aínda que o mecanismo exacto da regulación á alza da PCx en neuronas disfuncionais in vivo aínda está por caracterizar, demostramos que esta resposta prematura xoga un papel importante no mantemento do estado redox das neuronas, o que se demostrou en experimentos FLIM en cortes cerebelosos. En particular, impedir que as neuronas periféricas regulen á alza a PCx pode levar a un estado máis oxidado e acelerar a morte celular. A activación da degradación dos BCAA e a carboxilación do piruvato non son formas de caracterizar os tecidos periféricos da disfunción mitocondrial (7). Polo tanto, parecen ser unha característica prioritaria das neuronas con deficiencia de OXPHOS, aínda que non sexa a única característica, que é importante para a neurodexeneración. .
A enfermidade cerebelosa é un tipo heteroxéneo de enfermidade neurodexenerativa que xeralmente se manifesta como ataxia e a miúdo dana as NP (46). Esta poboación de neuronas é particularmente vulnerable á disfunción mitocondrial porque a súa dexeneración selectiva en ratos é suficiente para reproducir moitos dos síntomas motores que caracterizan a ataxia espiñocerebelosa humana (16, 47, 48). Segundo os informes, un modelo de rato transxénico cun xene mutante está asociado á ataxia espiñocerebelosa humana e ten disfunción mitocondrial (49, 50), o que enfatiza a importancia de estudar as consecuencias da deficiencia de OXPHOS na PNPH. Polo tanto, é particularmente axeitado illar e estudar eficazmente esta poboación de neuronas única. Non obstante, dado que as NP son moi sensibles á presión e representan unha baixa proporción de toda a poboación de células cerebelosas, para moitos estudos baseados na ómica, a separación selectiva delas como células enteiras segue sendo un aspecto desafiante. Aínda que é case imposible lograr a ausencia absoluta de contaminación doutros tipos de células (especialmente tecidos adultos), combinamos un paso de disociación eficaz con FACS para obter un número suficiente de neuronas viables para a análise proteómica posterior, e temos unha cobertura de proteínas bastante alta (arredor de 3000 proteínas) en comparación co conxunto de datos existente de todo o cerebelo (51). Ao preservar a viabilidade das células enteiras, o método que proporcionamos aquí permítenos non só comprobar os cambios nas vías metabólicas nas mitocondrias, senón tamén comprobar os cambios nas súas contrapartes citoplasmáticas, o que complementa o uso de etiquetas de membrana mitocondrial para enriquecer o tipo de célula. O novo método para o número de mitocondrias en tecidos complexos (52, 53). O método que describimos non só está relacionado co estudo das células de Purkinje, senón que se pode aplicar facilmente a calquera tipo de célula para abordar os cambios metabólicos en cerebros enfermos, incluídos outros modelos de disfunción mitocondrial.
Finalmente, identificamos unha xanela terapéutica durante este proceso de rearranxo metabólico que pode reverter completamente os signos clave do estrés celular e previr a dexeneración neuronal. Polo tanto, comprender as implicacións funcionais do recableado descrito aquí pode proporcionar información fundamental sobre posibles tratamentos para manter a viabilidade neuronal durante a disfunción mitocondrial. É necesaria unha investigación futura dirixida a analizar os cambios no metabolismo enerxético noutros tipos de células cerebrais para revelar completamente a aplicabilidade deste principio a outras enfermidades neurolóxicas.
Os ratos MitoPark xa foron descritos previamente (31). Os ratos C57BL/6N con xenes Mfn2 flanqueantes por loxP foron descritos previamente (18) e cruzados con ratos L7-Cre (23). A proxenie dobre heterocigota resultante cruzouse despois con ratos Mfn2loxP/Mfn2loxP homocigotos para xerar eliminacións de xenes específicos de Purkinje para Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Nun subconxunto de apareamento, o alelo Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) introduciuse mediante cruzamentos adicionais (20). Todos os procedementos con animais realizáronse de acordo coas directrices europeas, nacionais e institucionais e foron aprobados polo LandesamtfürNatur de Umwelt e Verbraucherschutz, Renania do Norte-Westfalia, Alemaña. O traballo con animais tamén segue as directrices da Federación Europea de Asociacións de Ciencias de Animais de Laboratorio.
Despois de anestesiar a dislocación cervical da muller embarazada, illábase o embrión de rato (E13). O córtex diseccionábase en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) suplementada con 10 mM de Hepes e pasaba por medio de Eagle modificado por Dulbecco que contiña papaína (20 U/ml) e cisteína (1 μg/ml). Incubase o tecido en DMEM e disociábase mediante dixestión encimática (Ml) a 37 °C durante 20 minutos e, a continuación, moíase mecanicamente en DMEM suplementado cun 10 % de soro fetal bovino. As células sementábanse en cubreobxectivos de vidro recubertos con polilisina a unha densidade de 2 × 10⁶ por placa de cultivo de 6 cm ou a unha densidade de 0,5 × 10⁶ células/cm² para a análise de imaxes. Despois de 4 horas, o medio substituíase por medio sen soro Neurobasal que contiña un 1 % de suplemento de B27 e 0,5 mM de GlutaMax. As neuronas mantivéronse a continuación a 37 °C e cun 5 % de CO2 durante todo o experimento e alimentáronse unha vez por semana. Para inducir a recombinación in vitro, utilizáronse 3 μl (placa de cultivo de 24 pozos) ou 0,5 μl (placa de 24 pozos) do seguinte vector de virus AAV9 para tratar as neuronas o segundo día in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, número de catálogo 105530-AAV9) e AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, número de catálogo 105545-AAV9).
O ADN complementario de Mfn1 e Mfn2 de rato (obtido do plásmido Addgene #23212 e #23213, respectivamente) está marcado coa secuencia V5 (GKPINPLLGLDST) no extremo C-terminal e está fusionado con mCherry no marco de referencia a través da secuencia T2A. Grx1-roGFP2 é unha doazón de Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Ao substituír o casete tdTomato mediante métodos de clonación convencionais, o casete foi subclonado na cadea principal pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (número de referencia Addgene 28306) para xerar os vectores pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 e pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Empregouse unha estratexia similar para xerar o vector de control pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Para xerar a construción AAV-shPCx, requírese un vector AAV plasmídico (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), que contén a secuencia de ADN que codifica o shRNA que dirixe o PCx de rato (5′CTTTCGCTCTAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Baixo o control do promotor U6, utilízase mCherry baixo o control do promotor CMV. A produción de vectores AAV auxiliares levouse a cabo segundo as instrucións do fabricante (Cell Biolabs). En resumo, úsase un plásmido de transferencia que leve o xene codificante mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) transitoriamente. Transfección do xene codificante de células 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ou Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), así como a proteína da cápside AAV1 e a proteína accesoria. Plásmido de empaquetamento, utilizando o método de fosfato cálcico. O sobrenadante do virus bruto obtívose mediante ciclos de conxelación-desconxelación nun baño de xeo seco/etanol e as células lisáronse en solución salina tamponada con fosfato (PBS). O vector AAV purificouse mediante ultracentrifugación en gradiente descontinuo de iodixanol (24 horas a 32.000 rpm e 4 °C) e concentrouse cun filtro centrífugo Amicon ultra-15. O título xenómico de AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 copias do xenoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX realizouse como se describiu previamente (54), e mediuse mediante PCR cuantitativa en tempo real (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
As neuronas primarias foron raspadas en PBS 1x arrefriado con xeo, sedimentadas e logo homoxeneizadas en tampón de lise de Triton X-100 ao 0,5 % / desoxicolato de sodio ao 0,5 % / PBS que contiña fosfatase e inhibidor da protease (Roche). A cuantificación de proteínas realizouse mediante o ensaio de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific). As proteínas foron separadas por electroforese en xel de SDS-poliacrilamida e logo transferidas a unha membrana de fluoruro de polivinilideno (GE Healthcare). Bloquear os sitios non específicos e incubar co anticorpo primario (ver Táboa S1 para máis detalles) en leite ao 5 % en TBST (solución salina tamponada con Tris con Tween), pasos de lavado e anticorpo secundario en incubación TBST. Incubar co anticorpo primario durante a noite a +4 °C. Despois de lavar, aplicar o anticorpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, incubando o mesmo blot cun anticorpo anti-β-actina, confirmouse a mesma carga. Detección mediante conversión a quimioluminiscencia e potenciación da quimioluminiscencia (GE Healthcare).
As neuronas previamente sembradas en cubreobxectivos de vidro fixáronse con paraformaldehído (PFA) ao 4 %/PBS no punto de tempo especificado a temperatura ambiente durante 10 minutos. Os cubreobxectivos perméanse primeiro con Triton X-100/PBS ao 0,1 % durante 5 minutos a temperatura ambiente e, a continuación, en tampón de bloqueo [albumina sérica bovina (BSA) ao 3 %/PBS]. O segundo día, os cubreobxectivos laváronse con tampón de bloqueo e incubáronse co anticorpo secundario conxugado con fluoróforo axeitado durante 2 horas a temperatura ambiente; finalmente, as mostras laváronse completamente en PBS con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), contratinúronse e, a continuación, fixáronse no portaobxectivos de microscopio con Aqua-Poly/Mount.
Anestesiáronse ratos (machos e femias) mediante inxección intraperitoneal de ketamina (130 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e administróuselles por vía subcutánea analxésico carprofeno (5 mg/kg). Colocáronse nun instrumento estereotáctico (Kopf) equipado cunha almofada térmica. Expúxose o cranio e use unha broca dental para adelgazar a parte do córtex cerebeloso correspondente ao óso mis (de lambda: cola 1,8, lateral 1, correspondente aos lóbulos IV e V). Use unha agulla de xiringa curva para crear coidadosamente un pequeno orificio no cranio para evitar interromper a vasculatura inferior. A continuación, insírese lentamente o capilar de vidro fino debuxado no microorificio (de -1,3 a -1 no lado ventral da duramadre) e inxéctanse de 200 a 300 nl de AAV no microinxector (Narishige) con xiringas manuais (Narishige) varias veces a baixa presión durante un período de tempo de 10 a 20 minutos. Despois da infusión, colóquese o capilar durante outros 10 minutos para permitir que o virus se propague completamente. Unha vez retirados os capilares, a pel cósese coidadosamente para minimizar a inflamación da ferida e permitir que o animal se recupere. Os animais foron tratados con analxésicos (caspofeno) durante varios días despois da operación, tempo durante o cal se controlou coidadosamente o seu estado físico e logo foron sacrificados no momento indicado. Todos os procedementos leváronse a cabo de acordo coas directrices europeas, nacionais e institucionais e foron aprobados por LandesamtfürNatur de Umwelt und Verbraucherschutz, Renania do Norte-Westfalia, Alemaña.
Os animais foron anestesiados con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), e o corazón foi perfundido primeiro con PBS 0,1 M e despois con PFA ao 4 % en PBS. O tecido foi diseccionado e fixado en PFA/PBS ao 4 % durante a noite a 4 °C. Utilizouse un coitelo vibratorio (Leica Microsystems GmbH, Viena, Austria) para preparar seccións sagitais (50 μm de grosor) do cerebro fixado en PBS. A menos que se especifique o contrario, a tinción das seccións flotantes realizouse como se describiu anteriormente (13) a temperatura ambiente e axitando. En resumo, primeiro, as láminas obtidas foron permeabilizadas con Triton X-100/PBS ao 0,5 % durante 15 minutos a temperatura ambiente; para algúns epítopos (Pcx e Shmt2), quentando as láminas durante 25 minutos en lugar deste paso en tampón tris-EDTA a 80 °C (PH 9). A continuación, as seccións incubáronse con anticorpo primario (véxase a Táboa S1) en tampón de bloqueo (3 % de BSA/PBS) a 4 °C durante a noite con axitación. Ao día seguinte, as seccións laváronse con tampón de bloqueo e incubáronse co anticorpo secundario conxugado con fluoróforo axeitado durante 2 horas a temperatura ambiente; finalmente, as seccións laváronse completamente en PBS, contratuníronse con DAPI e despois fixáronse con AquaPolymount nun portaobxectos de microscopio.
Empregouse un microscopio confocal de varrido láser (TCS SP8-X ou TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) equipado cun láser de luz branca e un láser ultravioleta de 405 díodos para obter imaxes da mostra. Ao excitar o fluoróforo e recoller o sinal cun detector híbrido (HyDs), utilizouse o software LAS-X para recoller imaxes apiladas segundo a mostraxe de Nyquist en modo secuencial: para paneis non cuantitativos, trátase de sinais altamente dinámicos (por exemplo, en células somáticas e dendritas) (mtYFP). Utilízase HyD para detectar o número de PN no modo BrightR). Aplícase unha abertura de 0,3 a 6 ns para reducir o fondo.
Imaxes en tempo real de células clasificadas. Despois da clasificación en medio Neurobasal-A que contiña un 1 % de suplemento de B27 e 0,5 mM de GlutaMax, as células sementáronse inmediatamente en láminas de vidro recubertas de poli-l-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, número de catálogo 80826) e despois mantivéronse a 37 °C e un 5 % de CO2 durante 1 hora para permitir que as células se asentasen. A imaxe en tempo real realizouse nun microscopio confocal de varrido láser Leica SP8 equipado cun láser branco, HyD, lente obxectiva de aceite de 63 × [apertura numérica (NA)] e unha etapa de quecemento.
O rato foi anestesiado rapidamente con dióxido de carbono e decapitado, o cerebro foi retirado rapidamente do cranio e cortado en seccións sagitais de 200 μm de grosor (para o experimento de marcaxe con 13C) ou 275 μm de grosor (para experimentos con dous fotóns) cheas cos seguintes materiais. O xeado (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemaña) está cheo das seguintes substancias: NaCl xeado a 125 mM saturado en carbono (95 % de O2 e 5 % de CO2), baixo contido en Ca2 + líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), KCl 2,5 mM, tampón fosfato de sodio 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, glicosa 25 mM, CaCl2 0,5 mM e MgCl2 3,5 mM (presión osmótica de 310 a 330 mmol). Transferir os cortes de cerebro obtidos a unha cámara de preincubación que conteña un medio con concentracións máis altas de Ca2 + ACSF (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glicosa, 1,0 mM de CaCl2 e 2,0 mM de MgCl2), pH 7,4 e de 310 a 320 mmol.
Durante o proceso de obtención de imaxes, as láminas trasladáronse a unha sala de obtención de imaxes específica e o experimento realizouse baixo perfusión continua de ACSF a unha temperatura constante de 32° a 33°C. Para a obtención de imaxes das láminas utilizouse un microscopio láser multifotónico de varrido (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) equipado cunha lente obxectiva Leica de 25 aumentos (NA 0,95, auga) e un láser de Ti: zafiro (Chameleon Vision II, Coherent). Módulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. Os cambios no estado redox citoplasmático das PN medíronse mediante FLIM de dous fotóns en cortes sagitais do cerebro, onde o biosensor Grx1-roGFP2 se dirixía ás PN. Na capa de PN, o campo de adquisición selecciónase entre 50 e 80 μm por debaixo da superficie do corte para garantir que exista unha PN viable (é dicir, a ausencia de estrutura en perlas ou cambios morfolóxicos neuronais ao longo das dendritas) e o sensor roGFP2 dobre positivo e o AAV que codifican o shRNA PCx ou a súa secuencia de control (cada un coexpresa mCherry). Recolle imaxes dunha soa pila con zoom dixital de 2x [lonxitude de onda de excitación: 890 nm; 512 nm 512 píxeles]. Detección: HyD interna, grupo de filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC)] e promediación da imaxe en 2 a 3 minutos utilízanse para garantir que se recollan suficientes fotóns (1000 fotóns en total) para o axuste da curva. A sensibilidade da sonda Grx1-roGFP2 e a verificación das condicións FLIM realizáronse monitorizando o valor da vida útil de roGFP2 ao engadir 10 mM de H2O2 exóxeno ao ACSF de perfusión (para maximizar a oxidación, o que resulta nun aumento da vida útil) e, a continuación, engadir 2 mM de ditiotreitol (minimiza o grao de redución, o que resulta nunha diminución da vida útil) (Figura S8, D a G). Empregouse o software FLIMfit 5.1.1 para analizar os resultados adquiridos, axustar a curva de decaemento exponencial única de toda a imaxe á IRF (función de resposta do instrumento) medida, e χ2 é aproximadamente 1. Para calcular a vida útil dunha soa PN, debuxouse manualmente a máscara arredor do corpo do nervio e utilizouse a vida útil media en cada máscara para a cuantificación.
Análise do potencial mitocondrial. Despois de incubar a sección aguda con 100 nM de TMRM engadido directamente ao ACSF perfundido durante 30 minutos, os cambios de potencial mitocondrial das PN medíronse cun microscopio de dous fotóns. A obtención de imaxes de TMRM realizouse excitando a sonda a 920 nm e usando HyD interna (isotiocianato de tetrametilrodamina: 585/40 nm) para recoller sinais; usando a mesma lonxitude de onda de excitación pero usando unha HyD interna diferente (FITC: 525/50) para visualizar mtYFP. Use o complemento Image Calculator de ImageJ para avaliar o potencial mitocondrial a nivel de célula individual. En resumo, a ecuación do complemento: sinal = min (mtYFP, TMRM) úsase para identificar a rexión mitocondrial que mostra o sinal TMRM en Purkinje Somali na imaxe confocal dunha soa pila do canal correspondente. Despois, a área de píxeles na máscara resultante cuantíficase e logo normalízase na imaxe de pila única de limiar correspondente do canal mtYFP para obter a fracción mitocondrial que mostra o potencial mitocondrial.
A imaxe foi deconvolucionada co software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Para as imaxes dixitalizadas de teselas, a montaxe dunha soa tesela realízase usando o algoritmo de unión automática proporcionado polo software LAS-X. Despois da calibración da imaxe, use ImageJ e Adobe Photoshop para procesar a imaxe e axustar uniformemente o brillo e o contraste. Use Adobe Illustrator para a preparación gráfica.
Análise do foco do ADNmt. O número de lesións do ADNmt cuantificouse en seccións cerebelosas marcadas con anticorpos contra o ADN mediante microscopio confocal. Creouse cada área diana para o corpo celular e o núcleo de cada célula, e a área respectiva calculouse usando o complemento Multi Measure (software ImageJ). Reste a área nuclear da área do corpo celular para obter a área citoplasmática. Finalmente, utilizouse o complemento Analyze Particles (software ImageJ) para cuantificar automaticamente os puntos de ADN citoplasmático que indican o ADNmt na imaxe limiar, e os resultados obtidos normalizáronse á media PN dos ratos CTRL. Os resultados exprésanse como o número medio de nucleósidos por célula.
Análise da expresión de proteínas. Emprega o complemento Image Calculator de ImageJ para avaliar a expresión de proteínas en PN a nivel de célula individual. En resumo, na imaxe confocal dunha soa capa do canal correspondente, mediante a ecuación: sinal = min (mtYFP, anticorpo), identifícase a rexión mitocondrial que mostra inmunorreactividade a un determinado anticorpo en Purkina. Despois, cuántificase a área de píxeles na máscara resultante e, a continuación, normalízase na imaxe de pila única de limiar correspondente do canal mtYFP para obter a fracción mitocondrial da proteína mostrada.
Análise da densidade celular de Purkinje. O complemento Cell Counter de ImageJ utilizouse para avaliar a densidade de Purkinje dividindo o número de células de Purkinje contadas pola lonxitude do anel cerebeloso ocupado polas células contadas.
Preparación e recollida de mostras. Os cerebros do grupo de control e dos ratos Mfn2cKO fixáronse en PFA ao 2 %/glutaraldehído ao 2,5 % en tampón fosfato (PB) 0,1 M e, a continuación, preparáronse seccións coronais utilizando ciliados (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) (grosor de 50 a 60 μm). Despois, fixáronse en tampón PB en tetraóxido de sodio ao 1 % e ferrocianuro de potasio ao 1,5 % a temperatura ambiente durante 1 hora. As seccións laváronse tres veces con auga destilada e, a continuación, tinguíronse con etanol ao 70 % que contiña acetato de uranilo ao 1 % durante 20 minutos. Despois, as seccións deshidratáronse en alcohol graduado e incluíronse en resina epoxi Durcupan ACM (resina de fundición Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 14040) entre láminas de vidro recubertas de silicona e, finalmente, polimerizáronse no forno a 60 °C durante 48 horas. Seleccionouse a área do córtex cerebeloso e cortáronse seccións ultrafinas de 50 nm en Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) e recolléronse nunha grella de fenda de cobre de 2×1 mm recuberta con película de poliestireno. As seccións tinguíronse cunha solución de acetato de uranilo ao 4 % en H2O durante 10 minutos, laváronse con H2O varias veces, despois con citrato de chumbo de Reynolds en H2O durante 10 minutos e, a continuación, laváronse con H2O varias veces. As micrografías realizáronse cun microscopio electrónico de transmisión Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) usando unha cámara dixital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, EUA). Alemaña).
Para os ratos infectados con AAV, separouse o cerebro e cortouse nunha sección sagital de 1 mm de grosor, e examinouse o cerebelo cun microscopio de fluorescencia para identificar o anel infectado con AAV (é dicir, que expresaba mCherry). Só se empregaron experimentos nos que a inxección de AAV produce unha eficiencia de transdución moi alta da capa de células de Purkinje (é dicir, case toda a capa) en polo menos dous aneis cerebelosos consecutivos. O bucle transducido con AAV microdisectouse para a súa fixación posterior durante a noite (4 % de PFA e 2,5 % de glutaraldehído en tampón de cocoato 0,1 M) e procesouse posteriormente. Para a inclusión de EPON, o tecido fixado lavouse con tampón de cocoato de sodio 0,1 M (Applicihem) e incubouse con OsO4 ao 2 % (os, Science Services; Caco) en tampón de cocoato de sodio 0,1 M (Applicihem) durante 4 horas e despois lavouse durante 2 horas. Repetiuse 3 veces con tampón de cocamida 0,1 M. Posteriormente, utilizouse a serie ascendente de etanol para incubar cada solución de etanol a 4 °C durante 15 minutos para deshidratar o tecido. O tecido transferiuse a óxido de propileno e incubouse durante a noite en EPON (Sigma-Aldrich) a 4 °C. Coloque o tecido en EPON fresco a temperatura ambiente durante 2 horas e, a continuación, inclúao a 62 °C durante 72 horas. Utilice un ultramicrotomo (Leica Microsystems, UC6) e unha coitela de diamante (Diatome, Biel, Suíza) para cortar seccións ultrafinas de 70 nm e tinguír con acetato de uranilo ao 1,5 % durante 15 minutos a 37 °C e tinguír cunha solución de citrato de chumbo durante 4 minutos. As micrografías electrónicas realizáronse cun microscopio electrónico de transmisión JEM-2100 Plus (JEOL) equipado con Camera OneView 4K de 16 bits (Gatan) e software DigitalMicrograph (Gatan). Para a análise, adquiríronse micrografías electrónicas cun zoom dixital de 5000× ou 10 000×.
Análise morfolóxica das mitocondrias. Para todas as análises, os contornos das mitocondrias individuais foron debuxados manualmente en imaxes dixitais usando o software ImageJ. Analízanse diferentes parámetros morfolóxicos. A densidade mitocondrial exprésase como unha porcentaxe obtida dividindo a área mitocondrial total de cada célula pola área do citoplasma (área do citoplasma = área celular - área do núcleo celular) × 100. A redondez das mitocondrias calcúlase coa fórmula [4π∙(área/perímetro 2)]. Analizouse a morfoloxía das mitocondrias e dividiuse en dúas categorías ("tubular" e "ampollas") segundo as súas formas principais.
Análise do número e da densidade de autofagosomas/lisosomas. Empregue o software ImageJ para delinear manualmente os contornos de cada autofagosoma/lisosoma na imaxe dixital. A área do autofagosoma/lisosoma exprésase como unha porcentaxe calculada dividindo a área total da estrutura do autofagosoma/lisosoma de cada célula pola área do citoplasma (área do citoplasma = área celular - área do núcleo) × 100. A densidade de autofagosomas/lisosomas calcúlase dividindo o número total polo número de estruturas de autofagosomas/lisosomas por célula (en termos de área citoplasmática) (área citoplasmática = área celular - área nuclear).
Etiquetado para a sección aguda e a preparación da mostra. Para experimentos que requiren marcado con glicosa, transfira os cortes de cerebro agudos a unha cámara de preincubación, que contén carbono saturado (95 % de O2 e 5 % de CO2), ACSF con alto contido de Ca2+ (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glicosa, 1,0 mM de CaCl2 e 2,0 mM de MgCl2, axustado a pH 7,4 e de 310 a 320 mOsm), na que a glicosa é substitución de glicosa 13C6- (Eurisotop, número de catálogo CLM-1396). Para os experimentos que requiren marcaxe con piruvato, transfira as seccións cerebrais agudas a un ACSF con maior concentración de Ca2 + (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato sódico, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glicosa, 1,0 mM de CaCl2 e engada 2,0 mM de MgCl2, axuste a pH 7,4 e de 310 a 320 mOsm) e engada 1 mM de 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, número de catálogo CLM-1082). Incube as seccións durante 90 minutos a 37 °C. Ao final do experimento, as seccións laváronse rapidamente cunha solución acuosa (pH 7,4) que contiña 75 mM de carbonato de amonio e, a continuación, homoxeneizáronse en acetonitrilo (ACN):metanol:auga 40:40:20 (v:v:v). Despois de incubar as seccións en xeo durante 30 minutos, as mostras centrifugáronse a 21 000 g durante 10 minutos a 4 °C e o sobrenadante transparente secouse nun concentrador SpeedVac. O precipitado de metabolitos seco resultante almacenouse a -80 °C ata a súa análise.
Análise por cromatografía líquida-espectrometría de masas de aminoácidos marcados con 13 C. Para a análise por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), o precipitado do metabolito resuspendiuse en 75 μl de auga de grao LC-MS (Honeywell). Despois da centrifugación a 21.000 g durante 5 minutos a 4 °C, utilizáronse 20 μl do sobrenadante clarificado para a análise do fluxo de aminoácidos, mentres que o resto do extracto utilizouse inmediatamente para a análise de anións (véxase máis abaixo). A análise de aminoácidos realizouse utilizando o protocolo de derivatización do cloruro de benzoílo descrito previamente (55, 56). No primeiro paso, engadíronse 10 μl de carbonato de sodio 100 mM (Sigma-Aldrich) a 20 μl de extracto de metabolitos e, a continuación, engadíronse 10 μl de cloruro de benzoílo ao 2 % (Sigma-Aldrich) ao ACN de grao LC. A mostra foi axitada brevemente en vórtice e logo centrifugada a 21.000 g durante 5 minutos a 20 °C. Transferir o sobrenadante purificado a un vial de mostraxe automática de 2 ml cun inserto cónico de vidro (200 μl de volume). As mostras foron analizadas usando o sistema LC de ultra alto rendemento Acquity iClass (Waters) conectado ao espectrómetro de masas de precisión de alta resolución Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Para a análise, inxectáronse 2 μl da mostra derivatizada nunha columna de sílice T3 de alta resistencia de 100 × 1,0 mm (Waters) que contiña partículas de 1,8 μm. O caudal é de 100 μl/min e o sistema tampón consiste no tampón A (10 mM de formiato de amonio e 0,15 % de ácido fórmico en auga) e no tampón B (ACN). O gradiente é o seguinte: 0 % de B aos 0 minutos; 0 % de B. 0 a 15 % de B entre 0 e 0,1 minutos; 15 a 17 % de B entre 0,1 e 0,5 minutos; B entre 17 e 55 % entre 0,5 e 14 minutos; B entre 55 e 70 % entre 14 e 14,5 minutos; 14,5 a 70 a 100 % de B entre 18 minutos; 100 % de B entre 18 e 19 minutos; 100 a 0 % de B entre 19 e 19,1 minutos; 0 % de B entre 19,1 e 28 minutos (55, 56). O espectrómetro de masas QE-HF funciona en modo de ionización positiva cun rango de masas de m/z (relación masa/carga) de 50 a 750. A resolución aplicada é de 60.000 e o obxectivo de ións de control de ganancia (AGC) obtido é de 3×106, e o tempo máximo de ións é de 100 milisegundos. A fonte de ionización por electropulverización (ESI) quentada funciona a unha tensión de pulverización de 3,5 kV, unha temperatura capilar de 250 °C, un fluxo de aire na vaíña de 60 UA (unidades arbitrarias) e un fluxo de aire auxiliar de 20 UA a 250 °C. A lente S está axustada a 60 UA.
Análise por cromatografía aniónica-MS de ácidos orgánicos marcados con 13C. O precipitado de metabolitos restante (55 μl) analizouse usando un sistema de cromatografía iónica Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) conectado a un espectrómetro de masas QE-HF (Thermo Fisher Scientific). En resumo, inxectáronse 5 μl de extracto de metabolitos nunha columna Dionex IonPac AS11-HC equipada con HPLC (2 mm × 250 mm, tamaño de partícula 4 μm, Thermo Fisher Scientific) en modo de bucle parcial de inserción cunha proporción de recheo de 1.) Columna de garda Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). A temperatura da columna mantense a 30 °C e o mostrador automático axústase a 6 °C. Usa un cartucho de hidróxido de potasio provisto de auga desionizada para xerar un gradiente de hidróxido de potasio a través do xerador de eluentes. Separación de metabolitos a un caudal de 380 μl/min, aplicando o seguinte gradiente: de 0 a 3 minutos, KOH 10 mM; de 3 a 12 minutos, KOH 10 a 50 mM; de 12 a 19 minutos, KOH 50 a 100 mM; de 19 a 21 minutos, KOH 100 mM; de 21 a 21,5 minutos, KOH 100 a 10 mM. A columna reequilibrouse con KOH 10 mM durante 8,5 minutos.
Os metabolitos eluídos combínanse cun fluxo de suplemento de isopropanol de 150 μl/min despois da columna e logo diríxense a un espectrómetro de masas de alta resolución que funciona en modo de ionización negativa. O MS monitoriza o rango de masas de m/z 50 a 750 cunha resolución de 60.000. O AGC está axustado a 1×106 e o ​​tempo máximo de ións mantense en 100 ms. A fonte ESI quentada funcionou a unha tensión de pulverización de 3,5 kV. Os outros axustes da fonte de ións son os seguintes: temperatura capilar 275 °C; fluxo de gas da vaíña, 60 UA; fluxo de gas auxiliar, 20 UA a 300 °C e axuste da lente S a 60 UA.
Análise de datos de metabolitos marcados con 13C. Empregouse o software TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific) para a análise de datos da proporción isotópica. A identidade de cada composto verificouse cun composto de referencia fiable e analizouse de forma independente. Para realizar a análise de enriquecemento isotópico, a área do cromatograma de ións extraídos (XIC) de cada isótopo 13C (Mn) extraeuse de [M + H] +, onde n é o número de carbonos do composto diana, utilizado para analizar aminoácidos ou [MH] + para analizar anións. A precisión de masa do XIC é inferior a cinco partes por millón e a precisión do tempo de transcrición é de 0,05 minutos. A análise de enriquecemento realízase calculando a proporción de cada isótopo detectado coa suma de todos os isótopos do composto correspondente. Estas proporcións danse como valores porcentuais para cada isótopo e os resultados exprésanse como porcentaxe de enriquecemento molar (MPE), como se describiu anteriormente (42).
O precipitado de neuronas conxelado homoxenizouse en metanol ao 80 % (v/v) arrefriado con xeo, axitouse en vórtice e incubouse a -20 °C durante 30 minutos. Volveuse a axitar a mostra en vórtice e axitouse a +4 °C durante 30 minutos. A mostra centrifugouse a 21 000 g durante 5 minutos a 4 °C e, a continuación, o sobrenadante resultante recolleuse e secouse cun concentrador SpeedVac a 25 °C para a súa posterior análise. Como se describiu anteriormente, realizouse unha análise por LC-MS nos aminoácidos das células clasificadas. Usando TraceFinder (versión 4.2, Thermo Fisher Scientific), realizouse a análise de datos empregando a masa monoisotópica de cada composto. A normalización cuantil dos datos dos metabolitos realizouse empregando o paquete de software preprocessCore (57).
Preparación das cortes. O rato foi anestesiado rapidamente con dióxido de carbono e decapitado, o cerebro foi retirado rapidamente do cranio e o coitelo vibratorio cheo de xeo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemaña) utilizouse para cortalo en seccións sagitais de 300 a 375 μm. Gasificación en carbono frío (95 % de O2 e 5 % de CO2). Baixo contido de Ca2 + ACSF (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón fosfato de sodio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glicosa, 1,0 mM de CaCl2 e 6,0 mM de MgCl2. Axustar a pH 7,4 e de 310 a 330 mOsm). Transferir os cortes de cerebro obtidos a unha cámara que conteña unha concentración máis alta de Ca2 + ACSF (125,0 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de tampón de fosfato de sodio, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glicosa, 4,0 mM de CaCl2 e 3,5 mM de MgCl2), pH 7,4 e 310 a 320 mOsm. Gardar os cortes durante 20 a 30 minutos para que se poidan restaurar antes da gravación.
gravación. Para todos os rexistros empregouse unha platina de microscopio equipada cunha cámara de rexistro fixa e unha lente obxectiva de inmersión en auga de 20 aumentos (Scientifica). As putativas células de Purkinje identificáronse por (i) tamaño corporal, (ii) localización anatómica do cerebelo e (iii) expresión do xene reporteiro fluorescente mtYFP. A pipeta de parche cunha resistencia de punta de 5 a 11 megaohmios extráese mediante un capilar de vidro de borosilicato (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Alemaña) e unha pipeta horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Todos os rexistros realizáronse cun amplificador de pinza de parche npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Alemaña), que estaba controlado polo software Signal (versión 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Reino Unido). O experimento rexistrouse a unha frecuencia de mostraxe de 12,5 kHz. O sinal fíltrase con dous filtros Bessel de paso curto con frecuencias de corte de 1,3 e 10 kHz respectivamente. A capacitancia da membrana e da pipeta compénsase mediante o circuíto de compensación usando o amplificador. Todos os experimentos realizáronse baixo o control dunha cámara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemaña), que estaba controlada polo software Hokawo (versión 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemaña).
Configuración e análise de células completas de rutina. Inmediatamente antes do rexistro, encha a pipeta coa solución interna que contén as seguintes substancias: 4,0 mM de KCl, 2,0 mM de NaCl, 0,2 mM de EGTA, 135,0 mM de gluconato de potasio, 10,0 mM de Hepes, 4,0 mM de ATP (Mg), 0,5 mM de trifosfato de guanosina (GTP) (Na) e 10,0 mM de fosfato de creatinina axustáronse a pH 7,25, e a presión osmótica foi de 290 mOsm (sacarosa). Inmediatamente despois de aplicar unha forza de 0 pA para romper a membrana, mediuse o potencial de membrana en repouso. A resistencia de entrada mídese aplicando correntes hiperpolarizadas de -40, -30, -20 e -10 pA. Mida a magnitude da resposta de voltaxe e use a lei de Ohm para calcular a resistencia de entrada. A actividade espontánea rexistrouse nunha pinza de voltaxe durante 5 minutos e a sPSC identificouse e mediuse en Igor Pro (versión 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregón, EUA) usando un script de recoñecemento semiautomático. A curva IV e a corrente de estado estacionario mídense fixando a batería a diferentes potenciais (comezando desde -110 mV) e aumentando a voltaxe en pasos de 5 mV. A produción de PA probouse aplicando unha corrente despolarizante. Fixe a cela a -70 mV mentres se aplica un pulso de corrente despolarizante. Axuste o tamaño do paso de cada unidade de rexistro por separado (de 10 a 60 pA). Calcule a frecuencia máxima de PA contando manualmente os picos de pulso que causan a frecuencia de PA máis alta. O limiar de PA analízase usando a segunda derivada do pulso de despolarización que primeiro activa un ou máis PA.
Configuración e análise do parche perforado. Realizar o rexistro do parche perforado empregando protocolos estándar. Empregar unha pipeta libre de ATP e GTP que non conteña os seguintes ingredientes: 128 mM de gluconato K, 10 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,1 mM de EGTA e 2 mM de MgCl2, e axustar a pH 7,2 (usando KOH). O ATP e o GTP omítense da solución intracelular para evitar a permeabilidade incontrolada da membrana celular. A pipeta do parche énchese cunha solución interna que contén anfotericina (aproximadamente de 200 a 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) para obter un rexistro do parche perforado. A anfotericina disolveuse en dimetilsulfóxido (concentración final: 0,1 a 0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). A concentración de DMSO empregada non tivo un efecto significativo nas neuronas estudadas. Durante o proceso de perforación, a resistencia do canal (Ra) monitorizouse continuamente e o experimento comezou despois de que a amplitude de Ra e PA se estabilizasen (20-40 minutos). A actividade espontánea mídese nunha pinza de tensión e/ou corrente durante 2 a 5 minutos. A análise de datos realizouse usando Igor Pro (versión 7.05.2, WaveMetrics, EUA), Excel (versión 2010, Microsoft Corporation, Redmond, EUA) e GraphPad Prism (versión 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA (Estados Unidos). Para identificar PA espontáneos, utilízase o complemento NeuroMatic v3.0c de IgorPro. Identifica automaticamente os PA usando un limiar determinado, que se axusta individualmente para cada rexistro. Usando o intervalo de pico, determina a frecuencia de pico coa frecuencia de pico máxima instantánea e a frecuencia de pico media.
Illamento de PN. Adaptándose ao protocolo publicado previamente, as PN purificáronse do cerebelo do rato nunha fase específica (58). En resumo, o cerebelo diseccionouse e triturouse en medio de disociación con xeo [sen HBSS Ca2+ nin Mg2+, suplementado con 20 mM de glicosa, penicilina (50 U/ml) e estreptomicina (0,05 mg/ml)], e despois dixeriuse o medio en papaína [HBSS, suplementado con 1-cisteína·HCl (1 mg/ml), papaína (16 U/ml) e desoxirribonuclease I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Tratamento durante 30 minutos a 30 °C. Primeiro, lave os tecidos en medio HBSS que contén moco de ovo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) e DNase (0,1 mg/ml) a temperatura ambiente para evitar a dixestión encimática e, a continuación, no medio HBSS que contén 20 mM de glicosa. Moendo suavemente en HBSS, penicilina (50 U/ml), estreptomicina (0,05 mg/ml) e DNase (0,1 mg/ml) liberan células individuais. A suspensión celular resultante filtrouse a través dun coador celular de 70 μm, despois as células foron pelletadas por centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) e resuspendidas en medio de clasificación [HBSS, suplementado con 20 mM de glicosa, 20 % de soro fetal bovino), penicilina (50 U/ml) e estreptomicina (0,05 mg/ml)]; avalíe a viabilidade celular con ioduro de propidio e axuste a densidade celular a 1×10⁶ a 2×10⁶ células/ml. Antes da citometría de fluxo, a suspensión filtrouse a través dun coador celular de 50 μm.
Citómetro de fluxo. A clasificación celular realizouse a 4 °C usando a máquina FACSAria III (BD Biosciences) e o software FACSDiva (BD Biosciences, versión 8.0.1). A suspensión celular clasificouse usando unha boquilla de 100 μm a unha presión de 20 psi a unha velocidade de ~2800 eventos/seg. Dado que os criterios de activación tradicionais (tamaño celular, discriminación bimodal e características de dispersión) non poden garantir o illamento correcto da PN doutros tipos de células, a estratexia de activación establécese en función da comparación directa da intensidade da YFP e a autofluorescencia nos ratos mitoYFP+ ​​e nos ratos mitoYFP − de control. A YFP excítase irradiando a mostra cunha liña láser de 488 nm e o sinal detéctase usando un filtro de paso de banda de 530/30 nm. Nos ratos mitoYFP+, a forza relativa do xene reporteiro Rosa26-mitoYFP tamén se usa para distinguir os fragmentos do corpo neuronal e dos axóns. O 7-AAD excítase cun láser amarelo de 561 nm e detéctase cun filtro de paso de banda de 675/20 nm para excluír as células mortas. Para separar os astrocitos ao mesmo tempo, a suspensión celular tinguíuse con ACSA-2-APC, despois a mostra irradiouse cunha liña láser de 640 nm e utilizouse un filtro de paso de banda de 660/20 nm para detectar o sinal.
As células recollidas foron sedimentadas por centrifugación (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) e almacenadas a -80 °C ata o seu uso. Os ratos Mfn2cKO e as súas crías clasifícanse o mesmo día para minimizar a variabilidade do procedemento. A presentación e análise dos datos FACS realizáronse mediante o software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregón, EUA).
Como se mencionou anteriormente (59), a PCR en tempo real utilízase para illar o ADN das neuronas clasificadas para a posterior cuantificación do mtDNA. A linealidade e a sensibilidade do limiar comprobáronse inicialmente executando qPCR en diferentes números de células. En resumo, recóllense 300 PN nun tampón de lise composto por 50 mM de tris-HCl (pH 8,5), 1 mM de EDTA, 0,5 % de Tween 20 e proteinase K (200 ng/ml) e incubense a 55 °C durante 120 minutos. As células incubáronse adicionalmente a 95 °C durante 10 minutos para garantir a inactivación completa da proteinase K. Usando unha sonda TaqMan (Thermo Fisher) específica para mt-Nd1, o mtDNA mediuse mediante PCR semicuantitativa no sistema de PCR en tempo real 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Science, número de catálogo Mm04225274_s1), os xenes mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo AIVI3E8) e 18S (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo Hs99999901_s1).
Preparación da mostra do proteoma. Quentando a solución a 95 °C durante 10 minutos e sonicando, no tampón de lise [cloruro de guanidina 6 M, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 10 mM, cloroacetamida 10 mM e pellets de neuronas conxeladas de tris-Lise en HCl 100 mM]. Nun Bioruptor (Diagenode) durante 10 minutos (pulso de 30 segundos / período de pausa de 30 segundos). A mostra diluíuse 1:10 en tris-HCl 20 mM (pH 8,0), mesturouse con 300 ng de tripsina ouro (Promega) e incubouse durante a noite a 37 °C para lograr unha dixestión completa. O segundo día, a mostra centrifugouse a 20.000 g durante 20 minutos. O sobrenadante diluíuse con ácido fórmico ao 0,1 % e a solución desalouse con StageTips fabricadas por eles mesmos. A mostra secouse nun instrumento SpeedVac (concentrador Eppendorf plus 5305) a 45 °C e, a continuación, o péptido suspendeuse en ácido fórmico ao 0,1 %. Todas as mostras foron preparadas simultaneamente pola mesma persoa. Para analizar mostras de astrocitos, marcáronse 4 μg de péptidos desalgados cunha etiqueta de masa en tándem (TMT10plex, número de catálogo 90110, Thermo Fisher Scientific) cunha proporción de péptido e reactivo TMT de 1:20. Para o marcado TMT, resuspendiuse 0,8 mg de reactivo TMT en 70 μl de ACN anhidro e o péptido seco reconstituíuse en 9 μl de TEAB 0,1 M (bicarbonato de trietilamonio), ao que se lle engadiron 7 μl de reactivo TMT en ACN. A concentración foi do 43,75 %. Despois de 60 minutos de incubación, a reacción inactivouse con 2 μl de hidroxilamina ao 5 %. Os péptidos marcados recolléronse, secáronse, resuspendiuse en 200 μl de ácido fórmico (FA) ao 0,1 %, dividíronse en dous e logo desaláronse usando StageTips fabricados por eles mesmos. Usando un cromatógrafo líquido de ultra alto rendemento UltiMate 3000 (cromatógrafo líquido de ultra alto rendemento UltiMate 3000), unha das dúas metades fraccionouse nunha columna cromatográfica Acquity de 1 mm x 150 mm chea de partículas de C18 de 130 Å1,7 μm (Waters, nº de catálogo SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separar os péptidos a un caudal de 30 μl/min, separar do tampón B ao 1 % ao 50 % durante 85 minutos cun gradiente gradual de 96 minutos, do tampón B ao 50 % ao 95 % durante 3 minutos e despois 8 minutos para o tampón B ao 95 %; O tampón A é ACN ao 5 % e bicarbonato de amonio (ABC) a 10 mM, e o tampón B é ACN ao 80 % e ABC a 10 mM. Recoller as fraccións cada 3 minutos e combinalas en dous grupos (1 + 17, 2 + 18, etc.) e secar nunha centrífuga de baleiro.
Análise LC-MS/MS. Para a espectrometría de masas, os péptidos (número r119.aq) separáronse nunha columna analítica PicoFrit de 25 cm e 75 μm de diámetro interno (nova lente obxectiva, número de peza PF7508250) equipada con medio ReproSil-Pur 120 C18-AQ de 1,9 μm (Dr. Maisch, mat). Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemaña). A columna mantívose a 50 °C. Os tampóns A e B son ácido fórmico ao 0,1 % en auga e ácido fórmico ao 0,1 % en ACN ao 80 %, respectivamente. Os péptidos separáronse do tampón B ao 6 % ao 31 % durante 65 minutos e do tampón B ao 31 % ao 50 % durante 5 minutos cun gradiente de 200 nl/min. Os péptidos eluídos analizáronse nun espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). A medición m/z do precursor peptídico realízase cunha resolución de 120.000 no rango de 350 a 1.500 m/z. Usando unha enerxía de colisión normalizada do 27 %, selecciónase o precursor máis forte cun estado de carga de 2 a 6 para a clivaxe por disociación de trampa de C de alta enerxía (HCD). O tempo de ciclo establécese en 1 s. O valor m/z do fragmento peptídico mediuse na trampa de ións usando o obxectivo AGC máis pequeno de 5 × 104 e o tempo máximo de inxección de 86 ms. Despois da fragmentación, o precursor colocouse na lista de exclusión dinámica durante 45 s. Os péptidos marcados con TMT separáronse nunha columna Acclaim PepMap de 50 cm e 75 μm (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo 164942) e os espectros de migración analizáronse nun espectrómetro de masas tríbrido Orbitrap Lumos (Thermo Fisher Scientific) equipado con equipo de ións de forma de onda asimétrica de alto campo (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) que funciona a dúas tensións de compensación de −50 e −70 V. O MS3 seleccionado en función do precursor de sincronización utilízase para a medición do sinal de ións do informe TMT. A separación de péptidos levouse a cabo en EASY-nLC 1200, usando unha elución de gradiente lineal do 90 %, cunha concentración de tampón do 6 % ao 31 %; o tampón A era de 0,1 % de FA e o tampón B era de 0,1 % de FA e 80 % de ACN. A columna analítica funciona a 50 °C. Use FreeStyle (versión 1.6, Thermo Fisher Scientific) para dividir o ficheiro orixinal segundo a tensión de compensación FAIMS.
Identificación e cuantificación de proteínas. Usando o motor de busca integrado de Andromeda, os datos orixinais analizáronse coa versión 1.5.2.8 de MaxQuant (https://maxquant.org/). Ademais das secuencias da recombinase Cre e YFP obtidas de Aequorea victoria, buscáronse nos espectros de fragmentos de péptidos a secuencia canónica e a secuencia de isoformas do proteoma de referencia do rato (ID do proteoma UP000000589, descargado de UniProt en maio de 2017). A oxidación da metionina e a acetilación N-terminal das proteínas establecéronse como modificacións variables; a metilación do carbamoílo da cisteína estableceuse como modificacións fixas. Os parámetros de dixestión establécense en "especificidade" e "tripsina/P". O número mínimo de péptidos e péptidos raspadores utilizados para a identificación de proteínas é 1; o número mínimo de péptidos únicos é 0. Nas condicións de coincidencia do mapa de péptidos, a taxa de identificación de proteínas foi de 0,01. A opción "Segundo péptido" está activada. Emprega a opción "coincidencia entre execucións" para transferir identificacións exitosas entre diferentes ficheiros orixinais. Emprega a conta mínima de razón LFQ de 1 para a cuantificación sen etiquetas (LFQ) (60). A intensidade LFQ fíltrase para polo menos dous valores válidos en polo menos un grupo de xenotipos en cada punto de tempo e extrapólase dunha distribución normal cun ancho de 0,0,3 e móvese cara abaixo 1,8. Emprega a plataforma informática Perseus (https://maxquant.net/perseus/) e R (https://r-project.org/) para analizar os resultados LFQ. Empregouse unha proba t moderada bidireccional do paquete de software limma para a análise de expresión diferencial (61). A análise exploratoria de datos realízase usando ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally e pheatmap. Os datos proteómicos baseados en TMT analizáronse usando MaxQuant versión 1.6.10.43. Busca datos proteómicos brutos da base de datos de proteómica humana de UniProt, que se descargou en setembro de 2018. A análise inclúe o factor de corrección da pureza isotópica proporcionado polo fabricante. Usa limma en R para a análise da expresión diferencial. Os datos orixinais, os resultados da busca na base de datos e o fluxo de traballo e os resultados da análise de datos almacénanse na alianza ProteomeXchange a través do repositorio de socios PRIDE co identificador do conxunto de datos PXD019690.
As anotacións funcionais enriquecen a análise. A ferramenta Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) empregouse para determinar a riqueza dos termos de anotación funcional do conxunto de datos ás 8 semanas (Figura 1). En resumo, a lista cuantitativa de proteínas obtida da análise de datos de LC-MS/MS (espectrometría de masas en tándem) utilízase cos seguintes criterios de filtro: Mus musculus selecciónase como especie e fondo, e a categoría mostra que o valor P axustado por Benjamini para un enriquecemento de 0,05 ou inferior considérase significativo. Para este gráfico, móstranse as cinco categorías de exceso principais en cada clúster en función do valor P axustado. Usando a proba t múltiple, usando o programa de impulso lineal de dúas etapas de Benjamini, Krieger e Yekutieli (Q = 5%), realízase unha análise de expresión de proteínas no curso do tempo nos candidatos importantes identificados en cada categoría e cada fila analízase por separado. Non é necesario adoptar unha desviación estándar consistente.
Para comparar os resultados deste estudo coas bases de datos publicadas e xerar un diagrama de Venn na Figura 1, combinamos a lista cuantitativa de proteínas coas anotacións de MitoCarta 2.0 (24). Empregamos a ferramenta en liña Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) para xerar o diagrama.
Para obter información detallada sobre os procedementos estatísticos empregados para a análise proteómica, consulte a sección correspondente de Materiais e métodos. Para todos os demais experimentos, pódese atopar información detallada na lenda correspondente. A menos que se especifique o contrario, todos os datos exprésanse como media ± SEM e todas as análises estatísticas realizáronse co software GraphPad Prism 8.1.2.
Para obter materiais complementarios para este artigo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Este é un artigo de acceso aberto distribuído baixo os termos da licenza Creative Commons Atribución-NonComercial, que permite o uso, a distribución e a reprodución en calquera medio, sempre que o uso final non sexa para beneficio comercial e a premisa sexa que a obra orixinal sexa correcta. Referencia.
Nota: Só che pedimos que facilites o teu enderezo de correo electrónico para que a persoa que recomendas á páxina saiba que queres que vexa o correo electrónico e que non é spam. Non capturaremos ningún enderezo de correo electrónico.
Esta pregunta úsase para comprobar se es visitante e evitar o envío automático de correo lixo.
Por E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
A análise proteómica de neuronas disfuncionais revelou que se activan programas metabólicos para contrarrestar a neurodexeneración.
Por E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
A análise proteómica de neuronas disfuncionais revelou que se activan programas metabólicos para contrarrestar a neurodexeneración.
©2020 Asociación Americana para o Avance da Ciencia. todos os dereitos reservados. AAAS é socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.