O artigo forma parte do tema de investigación "Tecnoloxías avanzadas de biorremediación e procesos de reciclaxe de compostos orgánicos sintéticos (COS). Ver os 14 artigos
Os hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) de baixo peso molecular, como o naftaleno e os naftalenos substituídos (metilnaftaleno, ácido naftoico, 1-naftil-N-metilcarbamato, etc.), úsanse amplamente en diversas industrias e son xenotóxicos, mutaxénicos e/ou canceríxenos para os organismos. Estes compostos orgánicos sintéticos (COS) ou xenobióticos considéranse contaminantes prioritarios e supoñen unha grave ameaza para o medio ambiente global e a saúde pública. A intensidade das actividades humanas (por exemplo, a gasificación do carbón, o refinado do petróleo, as emisións dos vehículos e as aplicacións agrícolas) determina a concentración, o destino e o transporte destes compostos ubicuos e persistentes. Ademais dos métodos de tratamento/eliminación físicos e químicos, as tecnoloxías verdes e respectuosas co medio ambiente, como a biorremediación, que utilizan microorganismos capaces de degradar completamente os COP ou convertelos en subprodutos non tóxicos, xurdiron como unha alternativa segura, rendible e prometedora. Varias especies bacterianas pertencentes aos filos Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia e Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus e Paenibacillus) e Actinobacteria (Rhodococcus e Arthrobacter) na microbiota do solo demostraron a capacidade de degradar varios compostos orgánicos. Os estudos metabólicos, a xenómica e a análise metaxenómica axúdannos a comprender a complexidade e diversidade catabólicas presentes nestas formas de vida simples, que se poden aplicar aínda máis para unha biodegradación eficiente. A existencia a longo prazo dos HAP deu lugar á aparición de novos fenotipos de degradación mediante a transferencia horizontal de xenes utilizando elementos xenéticos como plásmidos, transposóns, bacteriófagos, illas xenómicas e elementos conxugativos integrativos. A bioloxía de sistemas e a enxeñaría xenética de illados específicos ou comunidades modelo (consorcios) poden permitir unha biorremediación completa, rápida e eficiente destes HAP a través de efectos sinérxicos. Nesta revisión, centrámonos nas diferentes vías metabólicas e na súa diversidade, na composición e diversidade xenéticas e nas respostas/adaptacións celulares do naftaleno e das bacterias que degradan o naftaleno substituído. Isto proporcionará información ecolóxica para a aplicación no campo e a optimización das cepas para unha biorremediación eficiente.
O rápido desenvolvemento das industrias (petroquímicas, agricultura, produtos farmacéuticos, tinguiduras téxtiles, cosméticos, etc.) contribuíu á prosperidade económica mundial e á mellora do nivel de vida. Este desenvolvemento exponencial deu lugar á produción dun gran número de compostos orgánicos sintéticos (COS), que se utilizan para fabricar diversos produtos. Estes compostos estraños ou COS inclúen hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), pesticidas, herbicidas, plastificantes, tinguiduras, produtos farmacéuticos, organofosforados, retardantes de chama, solventes orgánicos volátiles, etc. Emítense á atmosfera, aos ecosistemas acuáticos e terrestres, onde teñen impactos multidimensionais, causando efectos prexudiciais en diversas bioformas mediante a alteración das propiedades fisicoquímicas e da estrutura da comunidade (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Moitos contaminantes aromáticos teñen impactos fortes e destrutivos en moitos ecosistemas intactos/puntos de biodiversidade quentes (por exemplo, arrecifes de coral, capas de xeo árticas/antárticas, lagos de alta montaña, sedimentos de augas profundas, etc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Estudos xeomicrobiolóxicos recentes demostraron que a deposición de materia orgánica sintética (por exemplo, contaminantes aromáticos) e os seus derivados nas superficies de estruturas artificiais (ambiente construído) (por exemplo, sitios do patrimonio cultural e monumentos feitos de granito, pedra, madeira e metal) acelera a súa degradación (Gadd 2017; Liu et al. 2018). As actividades humanas poden intensificar e empeorar a degradación biolóxica de monumentos e edificios a través da contaminación atmosférica e o cambio climático (Liu et al. 2020). Estes contaminantes orgánicos reaccionan co vapor de auga na atmosfera e aséntanse na estrutura, causando a degradación física e química do material. A biodegradación é amplamente recoñecida como cambios indesexables na aparencia e as propiedades dos materiais causados ​​por organismos vivos que afectan á súa conservación (Pochon e Jaton, 1967). Unha maior acción microbiana (metabolismo) destes compostos pode reducir a integridade estrutural, a eficacia da conservación e o valor cultural (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Por outra banda, nalgúns casos, demostrouse que a adaptación e a resposta microbiana a estas estruturas son beneficiosas, xa que forman biopelículas e outras costras protectoras que reducen a taxa de deterioración/descomposición (Martino, 2016). Polo tanto, o desenvolvemento de estratexias de conservación sostibles a longo prazo e eficaces para monumentos de pedra, metal e madeira require unha comprensión profunda dos procesos clave implicados neste proceso. En comparación cos procesos naturais (procesos xeolóxicos, incendios forestais, erupcións volcánicas, reaccións de plantas e bacterias), as actividades humanas provocan a liberación de grandes volumes de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) e outro carbono orgánico (CO) nos ecosistemas. Moitos HAP empregados na agricultura (insecticidas e pesticidas como o DDT, a atrazina, o carbaril, o pentaclorofenol, etc.), na industria (petróleo cru, lodos/residuos de petróleo, plásticos derivados do petróleo, PCB, plastificantes, deterxentes, desinfectantes, fumigantes, fragrancias e conservantes), en produtos de coidado persoal (protectores solares, desinfectantes, repelentes de insectos e almizcles policíclicos) e en municións (explosivos como o 2,4,6-TNT) son posibles xenobióticos que poden afectar á saúde planetaria (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna e Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Esta lista pódese ampliar para incluír compostos derivados do petróleo (fuel oils, lubricantes, asfaltenos), bioplásticos de alto peso molecular e líquidos iónicos (Amde et al., 2015). A táboa 1 enumera varios contaminantes aromáticos e as súas aplicacións en diversas industrias. Nos últimos anos, as emisións antropoxénicas de compostos orgánicos volátiles, así como de dióxido de carbono e outros gases de efecto invernadoiro, comezaron a aumentar (Dvorak et al., 2017). Non obstante, os impactos antropoxénicos superan significativamente os naturais. Ademais, descubrimos que unha serie de compostos orgánicos volátiles persisten en moitos entornos ambientais e foron identificados como contaminantes emerxentes con efectos adversos nos biomas (Figura 1). As axencias ambientais como a Axencia de Protección Ambiental dos Estados Unidos (USEPA) incluíron moitos destes contaminantes na súa lista de prioridades debido ás súas propiedades citotóxicas, xenotóxicas, mutaxénicas e canceríxenas. Polo tanto, necesítanse regulacións estritas de eliminación e estratexias eficaces para o tratamento/eliminación de residuos dos ecosistemas contaminados. Varios métodos de tratamento físico e químico, como a pirólise, o tratamento térmico oxidativo, a aireación do aire, os vertedoiros, a incineración, etc., son ineficaces e custosos e xeran subprodutos corrosivos, tóxicos e difíciles de tratar. Coa crecente concienciación ambiental global, os microorganismos capaces de degradar estes contaminantes e os seus derivados (como os haloxenados, nitro, alquilo e/ou metilo) están a atraer unha atención crecente (Fennell et al., 2004; Haritash e Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). O uso destes microorganismos candidatos autóctonos sós ou en cultivos mixtos (colonias) para a eliminación de contaminantes aromáticos ten vantaxes en termos de seguridade ambiental, custo, eficiencia, eficacia e sustentabilidade. Os investigadores tamén están a explorar a integración de procesos microbianos con métodos redox electroquímicos, concretamente sistemas bioelectroquímicos (BES), como unha tecnoloxía prometedora para o tratamento/eliminación de contaminantes (Huang et al., 2011). A tecnoloxía BES atraeu unha atención crecente debido á súa alta eficiencia, baixo custo, seguridade ambiental, funcionamento a temperatura ambiente, materiais biocompatibles e capacidade para recuperar subprodutos valiosos (por exemplo, electricidade, combustible e produtos químicos) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). A chegada da secuenciación xenómica de alto rendemento e das ferramentas/métodos ómicas proporcionou unha gran cantidade de información nova sobre a regulación xenética, a proteómica e a fluxómica das reaccións de varios microorganismos degradadores. A combinación destas ferramentas coa bioloxía de sistemas mellorou aínda máis a nosa comprensión da selección e o axuste fino das vías catabólicas obxectivo nos microorganismos (é dicir, deseño metabólico) para lograr unha biodegradación eficiente e eficaz. Para deseñar estratexias de biorremediación eficaces utilizando microorganismos candidatos axeitados, necesitamos comprender o potencial bioquímico, a diversidade metabólica, a composición xenética e a ecoloxía (autoecoloxía/sinecoloxía) dos microorganismos.
Fig. 1. Fontes e rutas dos HAP de baixo contido molecular a través de diversos entornos e diversos factores que afectan á biota. As liñas discontinuas representan as interaccións entre os elementos do ecosistema.
Nesta revisión, tentamos resumir os datos sobre a degradación de HAP simples como o naftaleno e os naftalenos substituídos por varios illantes bacterianos, abarcando as vías metabólicas e a diversidade, os encimas implicados na degradación, a composición/contido e a diversidade dos xenes, as respostas celulares e varios aspectos da biorremediación. Comprender os niveis bioquímicos e moleculares axudará a identificar cepas hóspedes axeitadas e a súa posterior enxeñaría xenética para a biorremediación eficaz destes contaminantes prioritarios. Isto axudará a desenvolver estratexias para o establecemento de consorcios bacterianos específicos do sitio para unha biorremediación eficaz.
A presenza dun gran número de compostos aromáticos tóxicos e perigosos (que cumpren a regra de Hückel 4n + 2π electróns, n = 1, 2, 3,...) supón unha seria ameaza para diversos medios ambientais como o aire, o solo, os sedimentos e as augas superficiais e subterráneas (Puglisi et al., 2007). Estes compostos teñen aneis de benceno simples (monocíclicos) ou múltiples aneis de benceno (policíclicos) dispostos en forma lineal, angular ou en clúster e presentan estabilidade (estabilidade/inestabilidade) no ambiente debido á alta enerxía de resonancia negativa e á inercia (inercia), o que se pode explicar pola súa hidrofobicidade e estado reducido. Cando o anel aromático é substituído por grupos metilo (-CH3), carboxilo (-COOH), hidroxilo (-OH) ou sulfonato (-HSO3), faise máis estable, ten unha maior afinidade polas macromoléculas e é bioacumulable nos sistemas biolóxicos (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Algúns hidrocarburos aromáticos policíclicos de baixo peso molecular (LMWAHs), como o naftaleno e os seus derivados [metilnaftaleno, ácido naftoico, naftalenosulfonato e 1-naftil N-metilcarbamato (carbarilo)], foron incluídos na lista de contaminantes orgánicos prioritarios pola Axencia de Protección Ambiental dos Estados Unidos como xenotóxicos, mutaxénicos e/ou carcinóxenos (Cerniglia, 1984). A liberación desta clase de NM-HAPs ao medio ambiente pode provocar a bioacumulación destes compostos en todos os niveis da cadea alimentaria, afectando así a saúde dos ecosistemas (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
As fontes e as vías de chegada dos HAP á biota prodúcense principalmente a través da migración e as interaccións entre diferentes compoñentes do ecosistema, como o solo, as augas subterráneas, as augas superficiais, os cultivos e a atmosfera (Arey e Atkinson, 2003). A figura 1 mostra as interaccións e a distribución de diferentes HAP de baixo peso molecular nos ecosistemas e as súas vías cara á exposición á biota/humanos. Os HAP deposítanse nas superficies como resultado da contaminación atmosférica e a través da migración (deriva) das emisións dos vehículos, os gases de escape industriais (gasificación do carbón, combustión e produción de coque) e a súa deposición. As actividades industriais como a fabricación de téxtiles sintéticos, colorantes e pinturas; a conservación da madeira; o procesamento do caucho; as actividades de fabricación de cemento; a produción de pesticidas; e as aplicacións agrícolas son as principais fontes de HAP nos sistemas terrestres e acuáticos (Bamforth e Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Os estudos demostraron que os solos das zonas suburbanas e urbanas, preto das autoestradas e das grandes cidades son máis susceptibles aos hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) debido ás emisións das centrais eléctricas, a calefacción residencial, as cargas de tráfico aéreo e rodado e as actividades de construción (Suman et al., 2016). (2008) mostrou que os HAP no solo preto das estradas en Nova Orleáns, Luisiana, EUA, alcanzaban os 7189 μg/kg, mentres que en espazos abertos só alcanzaban os 2404 μg/kg. Do mesmo xeito, informouse de niveis de HAP de ata 300 μg/kg en zonas preto de sitios de gasificación de carbón en varias cidades dos Estados Unidos (Kanaly e Harayama, 2000; Bamforth e Singleton, 2005). Informouse de que os solos de varias cidades da India, como Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni e Venkataraman, 2000) e Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014), conteñen altas concentracións de HAP. Os compostos aromáticos adsórbense máis facilmente ás partículas do solo, á materia orgánica e aos minerais arxilosos, converténdose así en importantes sumidoiros de carbono nos ecosistemas (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). As principais fontes de HAP nos ecosistemas acuáticos son as precipitacións (precipitación húmida/seca e vapor de auga), a escorrentía urbana, a descarga de augas residuais, a recarga de augas subterráneas, etc. (Srogi, 2007). Estímase que arredor do 80 % dos HAP nos ecosistemas mariños derivan da precipitación, a sedimentación e a descarga de residuos (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). As maiores concentracións de HAP nas augas superficiais ou nos lixiviados dos vertedoiros de residuos sólidos acaban por filtrarse ás augas subterráneas, o que supón unha importante ameaza para a saúde pública, xa que máis do 70 % da poboación do sur e sueste asiático bebe augas subterráneas (Duttagupta et al., 2019). Un estudo recente realizado por Duttagupta et al. (2020) sobre análises de ríos (32) e augas subterráneas (235) de Bengala Occidental, na India, descubriu que aproximadamente o 53 % dos residentes urbanos e o 44 % dos residentes rurais (un total de 20 millóns de residentes) poden estar expostos ao naftaleno (4,9–10,6 μg/L) e os seus derivados. Os patróns de uso diferencial da terra e o aumento da extracción de augas subterráneas considéranse os principais factores que controlan o transporte vertical (advección) de HAP de baixo peso molecular no subsolo. Descubriuse que a escorrentía agrícola, as verteduras de augas residuais municipais e industriais e as verteduras de residuos sólidos/lixo están afectadas polos HAP nas concas fluviais e nos sedimentos do subsolo. As precipitacións atmosféricas agravan aínda máis a contaminación por HAP. Informáronse de altas concentracións de HAP e os seus derivados alquílicos (51 en total) en ríos/concas hidrográficas de todo o mundo, como o río Fraser, o río Louan, o río Denso, o río Missouri, o río Anacostia, o río Ebro e o río Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Nos sedimentos da conca do río Ganxes, o naftaleno e o fenantreno foron os máis significativos (detectados no 70 % das mostras) (Duttagupta et al., 2019). Ademais, os estudos demostraron que a cloración da auga potable pode levar á formación de HAP osixenados e clorados máis tóxicos (Manoli e Samara, 1999). Os HAP acumúlanse nos cereais, froitas e verduras como resultado da absorción polas plantas de solos contaminados, augas subterráneas e precipitacións (Fismes et al., 2002). Moitos organismos acuáticos como peixes, mexillóns, ameixas e camaróns están contaminados con HAP a través do consumo de alimentos e auga de mar contaminados, así como a través dos tecidos e a pel (Mackay e Fraser, 2000). Os métodos de cocción/procesamento como grellar, asar, afumar, fritir, secar, cocer ao forno e cociñar con carbón vexetal tamén poden levar a cantidades significativas de HAP nos alimentos. Isto depende en gran medida da elección do material de afumado, o contido de hidrocarburos fenólicos/aromáticos, o procedemento de cocción, o tipo de quentador, o contido de humidade, o subministro de osíxeno e a temperatura de combustión (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Tamén se detectaron hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) no leite en concentracións variables (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). A acumulación destes HAP nos alimentos tamén depende das propiedades fisicoquímicas dos alimentos, mentres que os seus efectos tóxicos están relacionados coas funcións fisiolóxicas, a actividade metabólica, a absorción, a distribución e a distribución corporal (Mechini et al., 2011).
A toxicidade e os efectos nocivos dos hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) coñécense desde hai moito tempo (Cherniglia, 1984). Os hidrocarburos aromáticos policíclicos de baixo peso molecular (HAP-LMW) (de dous a tres aneis) poden unirse covalentemente a varias macromoléculas como ADN, ARN e proteínas e son canceríxenos (Santarelli et al., 2008). Debido á súa natureza hidrofóbica, están separados por membranas lipídicas. Nos humanos, as monooxixenases do citocromo P450 oxidan os HAP a epóxidos, algúns dos cales son altamente reactivos (por exemplo, o epóxido de bediol) e poden levar á transformación de células normais en malignas (Marston et al., 2001). Ademais, os produtos de transformación dos HAP, como as quinonas, os fenois, os epóxidos, os diois, etc., son máis tóxicos que os compostos orixinais. Algúns HAP e os seus intermediarios metabólicos poden afectar as hormonas e varios encimas no metabolismo, afectando así negativamente o crecemento, o sistema nervioso central, os sistemas reprodutivo e inmunitario (Swetha e Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Informouse de que a exposición a curto prazo a HAP de baixo peso molecular causa función pulmonar prexudicada e trombose en asmáticos e aumenta o risco de cancro de pel, pulmón, vexiga e gastrointestinal (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Estudos en animais tamén demostraron que a exposición aos HAP pode ter efectos adversos na función e o desenvolvemento reprodutivos e pode causar cataratas, danos renais e hepáticos e ictericia. Demostrouse que varios produtos de biotransformación de HAP, como diois, epóxidos, quinonas e radicais libres (catións), forman adutos de ADN. Demostrouse que os adutos estables alteran a maquinaria de replicación do ADN, mentres que os adutos inestables poden despurinar o ADN (principalmente a adenina e ás veces a guanina); ambos poden xerar erros que levan a mutacións (Schweigert et al. 2001). Ademais, as quinonas (benzo-/pan-) poden xerar especies reactivas de osíxeno (ROS), causando danos fatais ao ADN e outras macromoléculas, afectando así á función/viabilidade dos tecidos (Ewa e Danuta 2017). Informouse de que a exposición crónica a baixas concentracións de pireno, bifenilo e naftaleno causa cancro en animais de experimentación (Diggs et al. 2012). Debido á súa toxicidade letal, a limpeza/eliminación destes HAP dos lugares afectados/contaminados é unha prioridade.
Empregáronse varios métodos físicos e químicos para eliminar os HAP de lugares/ambientes contaminados. Procesos como a incineración, a descloración, a oxidación UV, a fixación e a extracción con solventes teñen moitas desvantaxes, como a formación de subprodutos tóxicos, a complexidade do proceso, problemas de seguridade e regulamentos, baixa eficiencia e alto custo. Non obstante, a biodegradación microbiana (chamada biorremediación) é unha alternativa prometedora que implica o uso de microorganismos en forma de cultivos puros ou colonias. En comparación cos métodos físicos e químicos, este proceso é respectuoso co medio ambiente, non invasivo, rendible e sostible. A biorremediación pódese levar a cabo no lugar afectado (in situ) ou nun lugar especialmente preparado (ex situ) e, polo tanto, considérase un método de remediación máis sostible que os métodos físicos e químicos tradicionais (Juhasz e Naidu, 2000; Andreoni e Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Comprender os pasos metabólicos microbianos implicados na degradación dos contaminantes aromáticos ten enormes implicacións científicas e económicas para a sustentabilidade ecolóxica e ambiental. Estímase que 2,1 × 1018 gramos de carbono (C) almacénanse en sedimentos e compostos orgánicos (é dicir, petróleo, gas natural e carbón, é dicir, combustibles fósiles) en todo o mundo, o que supón unha contribución significativa ao ciclo global do carbono. Non obstante, a rápida industrialización, a extracción de combustibles fósiles e as actividades humanas están a esgotar estes depósitos litosféricos de carbono, liberando anualmente uns 5,5 × 1015 g de carbono orgánico (como contaminantes) á atmosfera (Gonzalez-Gaya et al., 2019). A maior parte deste carbono orgánico entra nos ecosistemas terrestres e mariños a través da sedimentación, o transporte e a escorrentía. Ademais, os novos contaminantes sintéticos derivados dos combustibles fósiles, como os plásticos, os plastificantes e os estabilizadores de plásticos (ftalatos e os seus isómeros), contaminan gravemente os ecosistemas mariños, do solo e acuáticos e a súa biota, o que exacerba os riscos climáticos globais. Varios tipos de microplásticos, nanoplásticos, fragmentos de plástico e os seus produtos monoméricos tóxicos derivados do tereftalato de polietileno (PET) acumuláronse no Océano Pacífico entre América do Norte e o Sueste Asiático, formando a "Gran Mancha de Lixo do Pacífico", prexudicando a vida mariña (Newell et al., 2020). Estudos científicos demostraron que non é posible eliminar tales contaminantes/residuos por ningún método físico ou químico. Neste contexto, os microorganismos máis útiles son aqueles capaces de metabolizar oxidativamente os contaminantes en dióxido de carbono, enerxía química e outros subprodutos non tóxicos que finalmente entran noutros procesos do ciclo de nutrientes (H, O, N, S, P, Fe, etc.). Polo tanto, comprender a ecofisioloxía microbiana da mineralización de contaminantes aromáticos e o seu control ambiental é crucial para avaliar o ciclo microbiano do carbono, o orzamento neto de carbono e os riscos climáticos futuros. Dada a necesidade urxente de eliminar tales compostos do medio ambiente, xurdiron varias ecoindustrias centradas en tecnoloxías limpas. Alternativamente, a valorización dos residuos industriais/produtos químicos de refugallo acumulados nos ecosistemas (é dicir, a estratexia de conversión de residuos en riqueza) considérase un dos piares da economía circular e dos obxectivos de desenvolvemento sostible (Close et al., 2012). Polo tanto, comprender os aspectos metabólicos, encimáticos e xenéticos destes posibles candidatos á degradación é de suma importancia para a eliminación e biorremediación eficaces destes contaminantes aromáticos.
Entre os moitos contaminantes aromáticos, prestamos especial atención aos HAP de baixo peso molecular como o naftaleno e os naftalenos substituídos. Estes compostos son compoñentes principais dos combustibles derivados do petróleo, colorantes téxtiles, produtos de consumo, pesticidas (bólas de naftalina e repelentes de insectos), plastificantes e taninos e, polo tanto, están moi estendidos en moitos ecosistemas (Preuss et al., 2003). Informes recentes destacan a acumulación de concentracións de naftaleno en sedimentos de acuíferos, augas subterráneas e solos subterráneos, zonas vadosas e leitos de ríos, o que suxire a súa bioacumulación no medio ambiente (Duttagupta et al., 2019, 2020). A táboa 2 resume as propiedades fisicoquímicas, aplicacións e efectos sobre a saúde do naftaleno e os seus derivados. En comparación con outros HAP de alto peso molecular, o naftaleno e os seus derivados son menos hidrófobos, máis solubles en auga e están amplamente distribuídos nos ecosistemas, polo que adoitan utilizarse como substratos modelo para estudar o metabolismo, a xenética e a diversidade metabólica dos HAP. Un gran número de microorganismos son capaces de metabolizar o naftaleno e os seus derivados, e hai información completa dispoñible sobre as súas vías metabólicas, encimas e características reguladoras (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Ademais, o naftaleno e os seus derivados están designados como compostos prototipo para a avaliación da contaminación ambiental debido á súa alta abundancia e biodisponibilidade. A Axencia de Protección Ambiental dos Estados Unidos estima que os niveis medios de naftaleno son de 5,19 μg por metro cúbico do fume do cigarro, principalmente da combustión incompleta, e de 7,8 a 46 μg do fume lateral, mentres que a exposición á creosota e ao naftaleno é de 100 a 10 000 veces maior (Preuss et al. 2003). Descubriuse que o naftaleno, en particular, ten toxicidade respiratoria e carcinoxenicidade específicas para a especie, a rexión e o sexo. Baseándose en estudos en animais, a Axencia Internacional para a Investigación do Cancro (IARC) clasificou o naftaleno como un "posible carcinóxeno humano" (Grupo 2B)1. A exposición a naftalenos substituídos, principalmente por inhalación ou administración parenteral (oral), causa lesións nos tecidos pulmonares e aumenta a incidencia de tumores pulmonares en ratas e ratos (Programa Nacional de Toxicoloxía 2). Os efectos agudos inclúen náuseas, vómitos, dor abdominal, diarrea, dor de cabeza, confusión, suor profusa, febre, taquicardia, etc. Por outra banda, informouse de que o insecticida carbamato de amplo espectro carbaril (1-naftil N-metilcarbamato) é tóxico para invertebrados acuáticos, anfibios, abellas melíferas e humanos, e demostrouse que inhibe a acetilcolinesterase causando parálise (Smulders et al., 2003; Bulen e Distel, 2011). Polo tanto, comprender os mecanismos de degradación microbiana, regulación xenética, reaccións encimáticas e celulares é crucial para desenvolver estratexias de biorremediación en ambientes contaminados.
Táboa 2. Información detallada sobre as propiedades fisicoquímicas, os usos, os métodos de identificación e as enfermidades asociadas do naftaleno e os seus derivados.
En nichos contaminados, os contaminantes aromáticos hidrófobos e lipofílicos poden causar diversos efectos celulares no microbioma (comunidade) ambiental, como cambios na fluidez da membrana, na permeabilidade da membrana, no inchazo da bicapa lipídica, na interrupción da transferencia de enerxía (cadea de transporte de electróns/forza motriz de protóns) e na actividade das proteínas asociadas á membrana (Sikkema et al., 1995). Ademais, algúns intermediarios solubles como os catecols e as quinonas xeran especies reactivas de osíxeno (ROS) e forman adutos con ADN e proteínas (Penning et al., 1999). Así, a abundancia destes compostos nos ecosistemas exerce unha presión selectiva sobre as comunidades microbianas para que se convertan en degradadores eficientes a varios niveis fisiolóxicos, incluíndo a absorción/transporte, a transformación intracelular, a asimilación/utilización e a compartimentación.
Unha busca no Proxecto de Base de Datos Ribosómica II (RDP-II) revelou que se illaron un total de 926 especies bacterianas de medios ou cultivos de enriquecemento contaminados con naftaleno ou os seus derivados. O grupo Proteobacteria tivo o maior número de representantes (n = 755), seguido de Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) e bacterias non clasificadas (8) (Figura 2). Os representantes de γ-Proteobacteria (Pseudomonadales e Xanthomonadales) dominaron todos os grupos gramnegativos con alto contido de G+C (54 %), mentres que Clostridiales e Bacillales (30 %) foron grupos grampositivos con baixo contido de G+C. Informouse de que Pseudomonas (o número máis alto, 338 especies) é capaz de degradar o naftaleno e os seus derivados metílicos en varios ecosistemas contaminados (alcatrán de hulla, petróleo, cru, lodos, vertidos de petróleo, augas residuais, residuos orgánicos e vertedoiros), así como en ecosistemas intactos (solo, ríos, sedimentos e augas subterráneas) (Figura 2). Ademais, os estudos de enriquecemento e a análise metaxenómica dalgunhas destas rexións revelaron que as especies de Legionella e Clostridium non cultivadas poden ter capacidade degradativa, o que indica a necesidade de cultivar estas bacterias para estudar novas vías e diversidade metabólica.
Fig. 2. Diversidade taxonómica e distribución ecolóxica de representantes bacterianos en ambientes contaminados con naftaleno e derivados do naftaleno.
Entre os diversos microorganismos que degradan hidrocarburos aromáticos, a maioría son capaces de degradar o naftaleno como única fonte de carbono e enerxía. A secuencia de eventos implicados no metabolismo do naftaleno foi descrita para Pseudomonas sp. (cepas: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 e CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 e outras cepas (ND6 e AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis e Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; O metabolismo iníciase mediante unha dioxixenase multicompoñente [naftaleno dioxixenase (NDO), unha dioxixenase hidroxilante de anel] que cataliza a oxidación dun dos aneis aromáticos do naftaleno utilizando osíxeno molecular como outro substrato, convertendo o naftaleno en cis-naftalenodiol (Figura 3). O cis-dihidrodiol convértese en 1,2-dihidroxinaftaleno mediante unha deshidroxenase. A A dioxixenase de clivación do anel, 1,2-dihidroxinaftaleno dioxixenase (12DHNDO), converte o 1,2-dihidroxinaftaleno en ácido 2-hidroxicromeno-2-carboxílico. A isomerización cis-trans encimática produce trans-o-hidroxibencilidenpiruvato, que é clivado pola hidratase aldolase en aldehído salicílico e piruvato. O ácido orgánico piruvato foi o primeiro composto C3 derivado do esqueleto de carbono do naftaleno e dirixido á vía central do carbono. Ademais, a salicilaldehído deshidroxenase dependente de NAD+ converte o salicilaldehído en ácido salicílico. O metabolismo nesta fase denomínase "vía superior" da degradación do naftaleno. Esta vía é moi común na maioría das bacterias que degradan o naftaleno. Non obstante, hai algunhas excepcións; por exemplo, no termófilo Bacillus hamburgii 2, a degradación do naftaleno é iniciada pola naftaleno 2,3-dioxixenase para formar 2,3-dihidroxinaftaleno (Annweiler et al., 2000).
Figura 3. Rutas de degradación do naftaleno, metilnaftaleno, ácido naftoico e carbarilo. Os números circulados representan os encimas responsables da conversión secuencial do naftaleno e os seus derivados en produtos posteriores. 1 — naftaleno dioxixenase (NDO); 2, cis-dihidrodiol deshidroxenase; 3, 1,2-dihidroxinaftaleno dioxixenase; 4, isomerase do ácido 2-hidroxicromeno-2-carboxílico; 5, trans-O-hidroxibencilidenpiruvato hidratase aldolase; 6, salicilaldehído deshidroxenase; 7, salicilato 1-hidroxilase; 8, catecol 2,3-dioxixenase (C23DO); 9, 2-hidroximuconato semialdehído deshidroxenase; 10, 2-oxopent-4-enoato hidratase; 11, 4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolase; 12, acetaldehído deshidroxenase; 13, catecol-1,2-dioxixenase (C12DO); 14, muconato cicloisomerase; 15, muconolactona delta-isomerase; 16, β-cetoadipatenolactona hidrolase; 17, β-cetoadipato succinil-CoA transferase; 18, β-cetoadipato-CoA tiolase; 19, succinil-CoA: acetil-CoA succiniltransferase; 20, salicilato 5-hidroxase; 21 – xentisato 1,2-dioxixenase (GDO); 22, maleilpiruvato isomerase; 23, fumarilpiruvato hidrolase; 24, metilnaftaleno hidroxase (NDO); 25, hidroximetilnaftaleno deshidroxenase; 26, naftalaldehído deshidroxenase; 27, ácido 3-formilsalicílico oxidase; 28, hidroxiisoftalato descarboxilase; 29, carbaril hidrolase (CH); 30, 1-naftol-2-hidrolase.
Dependendo do organismo e da súa composición xenética, o ácido salicílico resultante metabolízase aínda máis a través da vía do catecol usando a salicilato 1-hidroxilase (S1H) ou a través da vía do xentisato usando a salicilato 5-hidroxilase (S5H) (Figura 3). Dado que o ácido salicílico é o principal intermediario no metabolismo do naftaleno (vía superior), os pasos desde o ácido salicílico ata o intermediario TCA adoitan denominarse vía inferior, e os xenes organízanse nun único operón. É común ver que os xenes do operón da vía superior (nah) e do operón da vía inferior (sal) están regulados por factores reguladores comúns; por exemplo, o NahR e o ácido salicílico actúan como indutores, o que permite que ambos operóns metabolicen completamente o naftaleno (Phale et al., 2019, 2020).
Ademais, o catecol é clivado ciclicamente a 2-hidroximuconato semialdehído a través da vía meta pola catecol 2,3-dioxixenase (C23DO) (Yen et al., 1988) e posteriormente hidrolizado pola 2-hidroximuconato semialdehído hidrolase para formar ácido 2-hidroxipent-2,4-dienoico. O 2-hidroxipent-2,4-dienoato convértese entón en piruvato e acetaldehído por unha hidratase (2-oxopent-4-enoato hidratase) e unha aldolase (4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolase) e logo entra na vía central do carbono (Figura 3). Alternativamente, o catecol é clivado ciclicamente a cis,cis-muconato a través da vía orto pola catecol 1,2-oxixenase (C12DO). A muconato cicloisomerase, a muconolactona isomerase e a β-cetoadipato-nolactona hidrolase converten o cis,cis-muconato en 3-oxoadipato, que entra na vía central do carbono a través do succinil-CoA e o acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figura 3).
Na vía do xentisato (2,5-dihidroxibenzoato), o anel aromático é clivado pola xentisato 1,2-dioxixenase (GDO) para formar maleilpiruvato. Este produto pode hidrolizarse directamente a piruvato e malato, ou pode isomerizarse para formar fumarilpiruvato, que logo pode hidrolizarse a piruvato e fumarato (Larkin e Day, 1986). A escolla da vía alternativa observouse tanto en bacterias gramnegativas como grampositivas a nivel bioquímico e xenético (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). As bacterias gramnegativas (Pseudomonas) prefiren usar ácido salicílico, que é un indutor do metabolismo do naftaleno, descarboxilándoo a catecol usando salicilato 1-hidroxilase (Gibson e Subramanian, 1984). Por outra banda, nas bacterias grampositivas (Rhodococcus), a salicilato 5-hidroxilase converte o ácido salicílico en ácido xentísico, mentres que o ácido salicílico non ten ningún efecto indutivo na transcrición dos xenes do naftaleno (Grund et al., 1992) (Figura 3).
Informouse de que especies como Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, especies de Pseudomonas e Mycobacterium poden degradar o monometilnaftaleno ou o dimetilnaftaleno (Dean-Raymond e Bartha, 1975; Cane e Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Entre elas, a vía de degradación do 1-metilnaftaleno e 2-metilnaftaleno de Pseudomonas sp. CSV86 foi claramente estudada a nivel bioquímico e encimático (Mahajan et al., 1994). O 1-metilnaftaleno metabolízase a través de dúas vías. Primeiro, o anel aromático é hidroxilado (o anel non substituído do metilnaftaleno) para formar cis-1,2-dihidroxi-1,2-dihidro-8-metilnaftaleno, que se oxida aínda máis a salicilato de metilo e metilcatecol, e logo entra na vía central do carbono despois da clivaxe do anel (Figura 3). Esta vía denomínase "vía da fonte de carbono". Na segunda "vía de desintoxicación", o grupo metilo pode ser hidroxilado por NDO para formar 1-hidroximetilnaftaleno, que se oxida aínda máis a ácido 1-naftoico e se excreta ao medio de cultivo como un produto sen saída. Os estudos demostraron que a cepa CSV86 non pode crecer en ácido 1- e 2-naftoico como única fonte de carbono e enerxía, o que confirma a súa vía de desintoxicación (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). No 2-metilnaftaleno, o grupo metilo sofre unha hidroxilación por hidroxilase para formar 2-hidroximetilnaftaleno. Ademais, o anel non substituído do anel de naftaleno sofre unha hidroxilación do anel para formar un dihidrodiol, que se oxida a 4-hidroximetilcatecol nunha serie de reaccións catalizadas por encimas e entra na vía central do carbono a través da vía de clivaxe do metaanel. De xeito similar, informouse de que S. paucimobilis 2322 utiliza NDO para hidroxilar o 2-metilnaftaleno, que se oxida aínda máis para formar salicilato de metilo e metilcatecol (Dutta et al., 1998).
Os ácidos naftoicos (substituídos/non substituídos) son subprodutos de desintoxicación/biotransformación que se forman durante a degradación do metilnaftaleno, fenantreno e antraceno e que se liberan no medio de cultivo usado. Informouse de que o illado do solo Stenotrophomonas maltophilia CSV89 é capaz de metabolizar o ácido 1-naftoico como fonte de carbono (Phale et al., 1995). O metabolismo comeza coa dihidroxilación do anel aromático para formar 1,2-dihidroxi-8-carboxinaftaleno. O diol resultante oxídase a catecol a través do 2-hidroxi-3-carboxibencilidenopiruvato, ácido 3-formilsalicílico, ácido 2-hidroxiisoftálico e ácido salicílico e entra na vía central do carbono a través da vía de clivaxe do metaanel (Figura 3).
O carbarilo é un pesticida do grupo dos carbamatos de naftilo. Desde a Revolución Verde na India na década de 1970, o uso de fertilizantes e pesticidas químicos provocou un aumento das emisións de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) procedentes de fontes agrícolas non puntuais (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Estímase que o 55 % (85 722 000 hectáreas) do total de terras de cultivo na India se trata con pesticidas químicos. Nos últimos cinco anos (2015-2020), o sector agrícola indio utilizou unha media de 55 000 a 60 000 toneladas de pesticidas ao ano (Departamento de Cooperativas e Benestar dos Agricultores, Ministerio de Agricultura, Goberno da India, agosto de 2020). Nas chairas do Ganxes setentrional e central (os estados con maior poboación e densidade de poboación), o uso de pesticidas nos cultivos está xeneralizado, predominando os insecticidas. O carbarilo (1-naftil-N-metilcarbamato) é un insecticida carbamato de amplo espectro, de moderada a moi tóxico, que se emprega na agricultura india a unha dose media de 100–110 toneladas. Véndese habitualmente co nome comercial Sevin e utilízase para controlar insectos (pulgóns, formigas de lume, pulgas, ácaros, arañas e moitas outras pragas do exterior) que afectan a unha variedade de cultivos (millo, soia, algodón, froitas e verduras). Algúns microorganismos como Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus e Arthrobacter tamén se poden empregar para controlar outras pragas. Informouse de que o RC100 pode degradar o carbarilo (Larkin e Day, 1986; Chapalamadugu e Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha e Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). A vía de degradación do carbarilo foi estudada amplamente a niveis bioquímico, encimático e xenético en illamentos do solo de Pseudomonas sp. cepas C4, C5 e C6 (Swetha e Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). A vía metabólica comeza coa hidrólise da unión éster pola carbaril hidrolase (CH4) para formar 1-naftol, metilamina e dióxido de carbono. O 1-naftol convértese entón en 1,2-dihidroxinaftaleno pola 1-naftol hidroxilase (1-NH), que se metaboliza aínda máis a través da vía central do carbono mediante salicilato e xentisato. Informouse de que algunhas bacterias que degradan o carbarilo o metabolizan a ácido salicílico mediante a clivaxe do anel orto do catecol (Larkin e Day, 1986; Chapalamadugu e Chaudhry, 1991). Cabe destacar que as bacterias que degradan o naftaleno metabolizan principalmente o ácido salicílico a través do catecol, mentres que as bacterias que degradan o carbarilo prefiren metabolizar o ácido salicílico a través da vía do xentisato.
O ácido naftalenosulfónico/ácido disulfónico e os derivados do ácido naftilaminasulfónico pódense empregar como intermediarios na produción de colorantes azoicos, axentes humectantes, dispersantes, etc. Aínda que estes compostos teñen baixa toxicidade para os humanos, as avaliacións de citotoxicidade demostraron que son letais para peixes, dafnias e algas (Greim et al., 1994). Informouse de que representantes do xénero Pseudomonas (cepas A3, C22) inician o metabolismo mediante a dobre hidroxilación do anel aromático que contén o grupo ácido sulfónico para formar un dihidrodiol, que se converte posteriormente en 1,2-dihidroxinaftaleno mediante a clivaxe espontánea do grupo sulfito (Brilon et al., 1981). O 1,2-dihidroxinaftaleno resultante catabólizase a través da vía clásica do naftaleno, é dicir, a vía do catecol ou xentisato (Figura 4). Demostrouse que o ácido aminonaftalenosulfónico e o ácido hidroxinaftalenosulfónico poden ser degradados completamente por consorcios bacterianos mixtos con vías catabólicas complementarias (Nortemann et al., 1986). Demostrouse que un membro do consorcio desulfuriza o ácido aminonaftalenosulfónico ou o ácido hidroxinaftalenosulfónico mediante 1,2-dioxixenación, mentres que o aminosalicilato ou o hidroxialicilato se libera no medio de cultivo como un metabolito sen saída e posteriormente é absorbido por outros membros do consorcio. O ácido naftalenosulfónico é relativamente polar pero pouco biodegradable e, polo tanto, pode metabolizarse a través de diferentes vías. A primeira desulfuración ocorre durante a dihidroxilación rexioselectiva do anel aromático e do grupo ácido sulfónico; a segunda desulfuración ocorre durante a hidroxilación do ácido 5-sulfosalicílico pola 5-hidroxilase do ácido salicílico para formar ácido xentísico, que entra na vía central do carbono (Brilon et al., 1981) (Figura 4). Os encimas responsables da degradación do naftaleno tamén son responsables do metabolismo do sulfonato de naftaleno (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figura 4. Rutas metabólicas para a degradación do sulfonato de naftaleno. Os números dentro dos círculos representan os encimas responsables do metabolismo do sulfonato de naftilo, similares/idénticos aos encimas descritos na FIG. 3.
Os HAP de baixo peso molecular (HBPM) son reducibles, hidrófobos e pouco solubles, polo que non son susceptibles á degradación/descomposición natural. Non obstante, os microorganismos aeróbicos son capaces de oxidalos absorbendo osíxeno molecular (O2). Estes encimas pertencen principalmente á clase das oxidorredutases e poden realizar diversas reaccións como a hidroxilación do anel aromático (mono ou dihidroxilación), a deshidroxenación e a clivaxe do anel aromático. Os produtos obtidos destas reaccións están nun estado de oxidación máis alto e metabolízanse máis facilmente a través da vía central do carbono (Phale et al., 2020). Informouse de que os encimas da vía de degradación son inducibles. A actividade destes encimas é moi baixa ou insignificante cando as células se cultivan en fontes de carbono simples como a glicosa ou os ácidos orgánicos. A táboa 3 resume os diversos encimas (oxixenases, hidrolases, deshidroxenases, oxidases, etc.) implicados no metabolismo do naftaleno e os seus derivados.
Táboa 3. Características bioquímicas dos encimas responsables da degradación do naftaleno e os seus derivados.
Os estudos de radioisótopos (18O2) demostraron que a incorporación de O2 molecular en aneis aromáticos por oxixenases é o paso máis importante para activar unha maior biodegradación dun composto (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). A incorporación dun átomo de osíxeno (O) do osíxeno molecular (O2) ao substrato iníciase mediante monooxixenases endóxenas ou exóxenas (tamén chamadas hidroxilases). Outro átomo de osíxeno redúcese a auga. As monooxixenases exóxenas reducen a flavina con NADH ou NADPH, mentres que nas endomonooxixenases a flavina redúcese polo substrato. A posición da hidroxilación resulta en diversidade na formación do produto. Por exemplo, a salicilato 1-hidroxilase hidroxila o ácido salicílico na posición C1, formando catecol. Por outra banda, a salicilato 5-hidroxilase multicompoñente (que contén subunidades de redutase, ferredoxina e oxixenase) hidroxila o ácido salicílico na posición C5, formando ácido xentísico (Yamamoto et al., 1965).
As dioxixenases incorporan dous átomos de O2 no substrato. Dependendo dos produtos formados, divídense en dioxixenases hidroxilantes de anel e dioxixenases clivantes de anel. As dioxixenases hidroxilantes de anel converten os substratos aromáticos en cis-dihidrodiois (por exemplo, naftaleno) e están moi estendidas entre as bacterias. Ata a data, demostrouse que os organismos que conteñen dioxixenases hidroxilantes de anel son capaces de crecer en diversas fontes de carbono aromáticas, e estes encimas clasifícanse como NDO (naftaleno), tolueno dioxixenase (TDO, tolueno) e bifenil dioxixenase (BPDO, bifenilo). Tanto o NDO como o BPDO poden catalizar a dobre oxidación e a hidroxilación da cadea lateral de varios hidrocarburos aromáticos policíclicos (tolueno, nitrotolueno, xileno, etilbenceno, naftaleno, bifenilo, fluoreno, indol, metilnaftaleno, naftalenosulfonato, fenantreno, antraceno, acetofenona, etc.) (Boyd e Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). O NDO é un sistema multicompoñente que consiste nunha oxidorredutase, unha ferredoxina e un compoñente oxixenase que contén un sitio activo (Gibson e Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). A unidade catalítica do NDO consiste nunha subunidade α grande e unha subunidade β pequena dispostas nunha configuración α3β3. O NDO pertence a unha gran familia de oxixenases e a súa subunidade α contén un sitio Rieske [2Fe-2S] e un ferro mononuclear non hemo, o que determina a especificidade do substrato do NDO (Parales et al., 1998). Normalmente, nun ciclo catalítico, dous electróns da redución do nucleótido de piridina transfírense ao ión Fe(II) no sitio activo a través dunha reductase, unha ferredoxina e un sitio Rieske. Os equivalentes redutores activan o osíxeno molecular, que é un requisito previo para a dihidroxilación do substrato (Ferraro et al., 2005). Ata a data, só uns poucos NDO foron purificados e caracterizados en detalle a partir de diferentes cepas e o control xenético das vías implicadas na degradación do naftaleno foi estudado en detalle (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). As dioxixenases que clivan o anel (encimas que clivan o anel endo ou orto e encimas que clivan o anel exodiol ou meta) actúan sobre compostos aromáticos hidroxilados. Por exemplo, a dioxixenase que cliva o anel orto é a catecol-1,2-dioxixenase, mentres que a dioxixenase que cliva o anel meta é a catecol-2,3-dioxixenase (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Ademais de varias oxixenases, tamén existen varias deshidroxenases responsables da deshidroxenación de dihidrodiois aromáticos, alcohois e aldehídos e do uso de NAD+/NADP+ como aceptores de electróns, que son algúns dos encimas importantes implicados no metabolismo (Gibson e Subramanian, 1984; Shaw e Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
As enzimas como as hidrolases (esterases, amidases) son unha segunda clase importante de enzimas que usan auga para clivar enlaces covalentes e presentan unha ampla especificidade de substrato. A carbaril hidrolase e outras hidrolases considéranse compoñentes do periplasma (transmembrana) en membros de bacterias gramnegativas (Kamini et al., 2018). O carbaril ten unha ligazón amida e unha ligazón éster; polo tanto, pode ser hidrolizado por esterase ou amidase para formar 1-naftol. Informouse de que o carbaril na cepa AC10023 de *Rhizobium rhizobium* e na cepa RC100 de *Arthrobacter* funcionan como unha esterase e unha amidase, respectivamente. O carbaril na cepa RC100 de *Arthrobacter* tamén funciona como unha amidase. Demostrouse que a RC100 hidroliza catro insecticidas da clase N-metilcarbamato, como o carbaril, o metomilo, o ácido mefenámico e o XMC (Hayaatsu et al., 2001). Informouse de que a CH en Pseudomonas sp. C5pp pode actuar sobre o carbarilo (100 % de actividade) e o acetato de 1-naftilo (36 % de actividade), pero non sobre a 1-naftilacetamida, o que indica que é unha esterase (Trivedi et al., 2016).
Estudos bioquímicos, patróns de regulación encimática e análises xenéticas demostraron que os xenes de degradación do naftaleno constan de dúas unidades reguladoras inducibles ou "operóns": nah (a "vía augas arriba", que converte o naftaleno en ácido salicílico) e sal (a "vía augas abaixo", que converte o ácido salicílico na vía central do carbono a través do catecol). O ácido salicílico e os seus análogos poden actuar como indutores (Shamsuzzaman e Barnsley, 1974). En presenza de glicosa ou ácidos orgánicos, o operón é reprimido. A figura 5 mostra a organización xenética completa da degradación do naftaleno (en forma de operón). Describíronse varias variantes/formas nomeadas do xene nah (ndo/pah/dox) e descubríronse que teñen unha alta homoloxía de secuencia (90 %) entre todas as especies de Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Os xenes da vía augas arriba do naftaleno estaban xeralmente dispostos nunha orde de consenso como se mostra na figura 5A. Tamén se informou de que outro xene, o nahQ, estaba implicado no metabolismo do naftaleno e que adoitaba estar situado entre o nahC e o nahE, pero a súa función real aínda non se describeu. Do mesmo xeito, o xene nahY, responsable da quimiotaxe sensible ao naftaleno, atopouse no extremo distal do operón nah nalgúns membros. En Ralstonia sp., o xene U2 que codifica a glutatión S-transferase (gsh) estaba situado entre o nahAa e o nahAb, pero non afectou ás características de utilización do naftaleno (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organización e diversidade xenéticas observadas durante a degradación do naftaleno entre especies bacterianas; (A) Vía superior do naftaleno, metabolismo do naftaleno a ácido salicílico; (B) Vía inferior do naftaleno, ácido salicílico a través do catecol ata a vía central do carbono; (C) ácido salicílico a través do xentisato ata a vía central do carbono.
A "vía inferior" (operón sal) consiste normalmente en nahGTHINLMOKJ e converte o salicilato en piruvato e acetaldehído a través da vía de clivaxe por metaring de catecol. Descubriuse que o xene nahG (que codifica a salicilato hidroxilase) está conservado no extremo proximal do operón (Fig. 5B). En comparación con outras cepas que degradan o naftaleno, en P. putida CSV86 os operóns nah e sal están en tándem e moi relacionados (uns 7,5 kb). Nalgunhas bacterias gramnegativas, como Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 e P. putida AK5, o naftaleno metabolízase como un metabolito central do carbono a través da vía xentisato (en forma do operón sgp/nag). O casete xénico represéntase normalmente na forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, onde nagR (que codifica un regulador de tipo LysR) se atopa no extremo superior (Figura 5C).
O carbarilo entra no ciclo central do carbono a través do metabolismo do 1-naftol, 1,2-dihidroxinaftaleno, ácido salicílico e ácido xentísico (Figura 3). Baseándose en estudos xenéticos e metabólicos, propúxose dividir esta vía en "augantes" (conversión de carbarilo en ácido salicílico), "media" (conversión de ácido salicílico en ácido xentísico) e "augantes" (conversión de ácido xentísico en intermediarios da vía central do carbono) (Singh et al., 2013). A análise xenómica de C5pp (supercontig A, 76,3 kb) revelou que o xene mcbACBDEF está implicado na conversión de carbarilo a ácido salicílico, seguido de mcbIJKL na conversión de ácido salicílico a ácido xentísico e mcbOQP na conversión de ácido xentísico a intermediarios de carbono central (fumarato e piruvato, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
Informouse de que os encimas implicados na degradación de hidrocarburos aromáticos (incluíndo o naftaleno e o ácido salicílico) poden ser inducidos polos compostos correspondentes e inhibidos por fontes de carbono simples como a glicosa ou os ácidos orgánicos (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Entre as diversas vías metabólicas do naftaleno e os seus derivados, estudáronse ata certo punto as características reguladoras do naftaleno e o carbarilo. No caso do naftaleno, os xenes tanto nas vías augas arriba como augas abaixo están regulados por NahR, un regulador positivo de acción trans de tipo LysR. É necesario para a indución do xene nah polo ácido salicílico e a súa posterior expresión de alto nivel (Yen e Gunsalus, 1982). Ademais, os estudos demostraron que o factor hóspede integrador (IHF) e o XylR (regulador transcricional dependente de sigma 54) tamén son fundamentais para a activación transcricional dos xenes no metabolismo do naftaleno (Ramos et al., 1997). Os estudos demostraron que os encimas da vía de apertura do meta-anelar de catecol, concretamente a catecol 2,3-dioxixenase, son inducidos en presenza de naftaleno e/ou ácido salicílico (Basu et al., 2006). Os estudos demostraron que os encimas da vía de apertura do orto-anelar de catecol, concretamente a catecol 1,2-dioxixenase, son inducidos en presenza de ácido benzoico e cis,cis-muconato (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Na cepa C5pp, cinco xenes, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR e mcbS, codifican reguladores pertencentes á familia LysR/TetR de reguladores transcricionais responsables de controlar a degradación do carbarilo. Descubriuse que o xene homólogo mcbG está estreitamente relacionado co regulador de tipo LysR PhnS (58 % de identidade de aminoácidos) implicado no metabolismo do fenantreno en Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Descubriuse que o xene mcbH está implicado na vía intermedia (conversión de ácido salicílico en ácido xentísico) e pertence ao regulador transcricional de tipo LysR NagR/DntR/NahR en Pseudomonas e Burkholderia. Informouse de que os membros desta familia recoñecen o ácido salicílico como unha molécula efectora específica para a indución de xenes de degradación. Por outra banda, identificáronse tres xenes, mcbN, mcbR e mcbS, pertencentes aos reguladores transcricionais de tipo LysR e TetR, na vía posterior (metabolitos da vía xentisato-central do carbono).
Nos procariotas, os procesos de transferencia horizontal de xenes (adquisición, intercambio ou transferencia) a través de plásmidos, transposóns, profagos, illas xenómicas e elementos conxugativos integrativos (ICE) son as principais causas da plasticidade nos xenomas bacterianos, o que leva á ganancia ou perda de funcións/trazos específicos. Isto permite que as bacterias se adapten rapidamente a diferentes condicións ambientais, proporcionando potenciais vantaxes metabólicas adaptativas ao hóspede, como a degradación de compostos aromáticos. Os cambios metabólicos adoitan conseguirse mediante o axuste fino dos operóns de degradación, os seus mecanismos reguladores e as especificidades encimáticas, o que facilita a degradación dunha gama máis ampla de compostos aromáticos (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Descubriuse que os casetes xénicos para a degradación do naftaleno están localizados nunha variedade de elementos móbiles como plásmidos (conxugativos e non conxugativos), transposóns, xenomas, ICE e combinacións de diferentes especies bacterianas (Figura 5). En Pseudomonas G7, os operóns nah e sal do plásmido NAH7 transcríbense na mesma orientación e forman parte dun transposón defectuoso que require a transposase Tn4653 para a súa mobilización (Sota et al., 2006). Na cepa de Pseudomonas NCIB9816-4, o xene atopouse no plásmido conxugativo pDTG1 como dous operóns (separados aproximadamente por 15 kb) que se transcribiron en direccións opostas (Dennis e Zylstra, 2004). Na cepa de Pseudomonas putida AK5, o plásmido non conxugativo pAK5 codifica o encima responsable da degradación do naftaleno a través da vía xentisato (Izmalkova et al., 2013). Na cepa de Pseudomonas PMD-1, o operón nah está situado no cromosoma, mentres que o operón sal está situado no plásmido conxugativo pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Non obstante, en Pseudomonas stutzeri AN10, todos os xenes de degradación do naftaleno (operóns nah e sal) están localizados no cromosoma e presumiblemente son recrutados mediante eventos de transposición, recombinación e rearranxo (Bosch et al., 2000). En Pseudomonas sp. CSV86, os operóns nah e sal están localizados no xenoma en forma de ICE (ICECSV86). A estrutura está protexida por tRNAGly seguida de repeticións directas que indican sitios de recombinación/unión (attR e attL) e unha integrase de tipo fago situada en ambos extremos de tRNAGly, polo que é estruturalmente similar ao elemento ICEclc (ICEclcB13 en Pseudomonas knackmusii para a degradación do clorocatecol). Informouse de que os xenes do ICE poden transferirse por conxugación cunha frecuencia de transferencia extremadamente baixa (10-8), transferindo así propiedades de degradación ao receptor (Basu e Phale, 2008; Phale et al., 2019).
A maioría dos xenes responsables da degradación do carbarilo están localizados en plásmidos. Arthrobacter sp. RC100 contén tres plásmidos (pRC1, pRC2 e pRC300), dos cales dous plásmidos conxugativos, pRC1 e pRC2, codifican os encimas que converten o carbarilo en xentisato. Por outra banda, os encimas implicados na conversión do xentisato nos metabolitos de carbono central están localizados no cromosoma (Hayaatsu et al., 1999). Bacterias do xénero Rhizobium. A cepa AC100, utilizada para a conversión de carbarilo en 1-naftol, contén o plásmido pAC200, que leva o xene cehA que codifica CH como parte do transposón Tnceh rodeado por secuencias similares a elementos de inserción (istA e istB) (Hashimoto et al., 2002). Na cepa CF06 de *Sphingomonas*, crese que o xene da degradación do carbarilo está presente en cinco plásmidos: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 e pCF05. A homoloxía do ADN destes plásmidos é alta, o que indica a existencia dun evento de duplicación xénica (Feng et al., 1997). Nun simbionte degradador de carbarilo composto por dúas especies de *Pseudomonas*, a cepa 50581 contén un plásmido conxugativo pCD1 (50 kb) que codifica o xene da carbarilo hidrolase mcd, mentres que o plásmido conxugativo da cepa 50552 codifica un encima degradador de 1-naftol (Chapalamadugu e Chaudhry, 1991). Na cepa WM111 de *Achromobacter*, o xene da furadán hidrolase mcd está situado nun plásmido de 100 kb (pPDL11). Demostrouse que este xene está presente en diferentes plásmidos (100, 105, 115 ou 124 kb) en diferentes bacterias de diferentes rexións xeográficas (Parekh et al., 1995). En Pseudomonas sp. C5pp, todos os xenes responsables da degradación do carbarilo están localizados nun xenoma que abrangue 76,3 kb de secuencia (Trivedi et al., 2016). A análise do xenoma (6,15 Mb) revelou a presenza de 42 MGE e 36 GEI, dos cales 17 MGE estaban localizados no supercontig A (76,3 kb) cun contido medio asimétrico de G+C (54–60 mol%), o que suxire posibles eventos de transferencia horizontal de xenes (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 exhibe unha disposición similar de xenes degradantes do carbarilo, pero estes xenes están localizados nun plásmido (Zhu et al., 2019).
Ademais da eficiencia metabólica a nivel bioquímico e xenómico, os microorganismos tamén presentan outras propiedades ou respostas como a quimiotaxe, as propiedades de modificación da superficie celular, a compartimentación, a utilización preferencial, a produción de biosurfactantes, etc., que lles axudan a metabolizar de forma máis eficiente os contaminantes aromáticos en ambientes contaminados (Figura 7).
Figura 7. Diferentes estratexias de resposta celular de bacterias ideais degradadoras de hidrocarburos aromáticos para unha biodegradación eficiente de compostos contaminantes estraños.
As respostas quimiotácticas considéranse factores que potencian a degradación de contaminantes orgánicos en ecosistemas heteroxéneamente contaminados. (2002) demostraron que a quimiotaxe de Pseudomonas sp. G7 ao naftaleno aumentou a taxa de degradación do naftaleno nos sistemas acuáticos. A cepa de tipo salvaxe G7 degradou o naftaleno moito máis rápido que unha cepa mutante con deficiencia de quimiotaxe. Descubriuse que a proteína NahY (538 aminoácidos con topoloxía de membrana) estaba cotranscrita cos xenes da vía metacleavage no plásmido NAH7 e, do mesmo xeito que os transdutores de quimiotaxe, esta proteína parece funcionar como un quimiorreceptor para a degradación do naftaleno (Grimm e Harwood 1997). Outro estudo realizado por Hansel et al. (2009) mostrou que a proteína é quimiotáctica, pero a súa taxa de degradación é alta. (2011) demostraron unha resposta quimiotáctica de Pseudomonas (P. putida) ao naftaleno gasoso, na que a difusión en fase gasosa resultou nun fluxo constante de naftaleno ás células, o que controlou a resposta quimiotáctica das células. Os investigadores aproveitaron este comportamento quimiotáctico para deseñar microbios que aumentasen a velocidade de degradación. Os estudos demostraron que as vías quimiosensoriais tamén regulan outras funcións celulares como a división celular, a regulación do ciclo celular e a formación de biopelículas, axudando así a controlar a velocidade de degradación. Non obstante, o aproveitamento desta propiedade (quimiotaxe) para unha degradación eficiente vese dificultado por varios obstáculos. Os principais obstáculos son: (a) diferentes receptores parálogos recoñecen os mesmos compostos/ligandos; (b) existencia de receptores alternativos, é dicir, tropismo enerxético; (c) diferenzas de secuencia significativas nos dominios sensoriais da mesma familia de receptores; e (d) falta de información sobre as principais proteínas sensoras bacterianas (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Ás veces, a biodegradación de hidrocarburos aromáticos produce múltiples metabolitos/intermediarios, que poden ser quimiotácticos para un grupo de bacterias pero repulsivos para outros, o que complica aínda máis o proceso. Para identificar as interaccións dos ligandos (hidrocarburos aromáticos) cos receptores químicos, construímos proteínas sensoras híbridas (PcaY, McfR e NahY) fusionando os dominios sensor e de sinalización de Pseudomonas putida e Escherichia coli, que se dirixen aos receptores de ácidos aromáticos, intermediarios de TCA e naftaleno, respectivamente (Luu et al., 2019).
Baixo a influencia do naftaleno e outros hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), a estrutura da membrana bacteriana e a integridade dos microorganismos sofren cambios significativos. Os estudos demostraron que o naftaleno interfire coa interacción da cadea acilo a través de interaccións hidrofóbicas, aumentando así o inchazo e a fluidez da membrana (Sikkema et al., 1995). Para contrarrestar este efecto prexudicial, as bacterias regulan a fluidez da membrana cambiando a proporción e a composición de ácidos graxos entre os ácidos graxos de cadea ramificada iso/anteiso e isomerizando os ácidos graxos cis-insaturados nos isómeros trans correspondentes (Heipieper e de Bont, 1994). En Pseudomonas stutzeri cultivada con tratamento con naftaleno, a proporción de ácidos graxos saturados e insaturados aumentou de 1,1 a 2,1, mentres que en Pseudomonas JS150 esta proporción aumentou de 7,5 a 12,0 (Mrozik et al., 2004). Cando se cultivaron en naftaleno, as células de Achromobacter KAs 3–5 mostraron agregación celular arredor de cristais de naftaleno e unha diminución da carga superficial celular (de -22,5 a -2,5 mV) acompañada de condensación citoplasmática e vacuolización, o que indica cambios na estrutura celular e nas propiedades da superficie celular (Mohapatra et al., 2019). Aínda que os cambios celulares/superficiais están directamente asociados cunha mellor absorción de contaminantes aromáticos, as estratexias de bioenxeñaría relevantes non se optimizaron completamente. A manipulación da forma celular raramente se utilizou para optimizar os procesos biolóxicos (Volke e Nikel, 2018). A eliminación de xenes que afectan á división celular provoca cambios na morfoloxía celular. A eliminación de xenes que afectan á división celular provoca cambios na morfoloxía celular. En Bacillus subtilis, demostrouse que a proteína SepF do septo celular está implicada na formación do septo e é necesaria para os pasos posteriores da división celular, pero non é un xene esencial. A eliminación de xenes que codifican as hidrolases peptídicas de glicano en Bacillus subtilis provocou un alongamento celular, un aumento da taxa de crecemento específica e unha mellora da capacidade de produción de encimas (Cui et al., 2018).
Propúxose a compartimentación da vía de degradación do carbarilo para lograr unha degradación eficiente das cepas de Pseudomonas C5pp e C7 (Kamini et al., 2018). Proponse que o carbarilo se transporta ao espazo periplásmico a través do septo da membrana externa e/ou a través de porinas difusibles. A CH é un encima periplásmico que cataliza a hidrólise do carbarilo a 1-naftol, que é máis estable, máis hidrófobo e máis tóxico. A CH localízase no periplásmico e ten unha baixa afinidade polo carbarilo, controlando así a formación de 1-naftol, evitando así a súa acumulación nas células e reducindo a súa toxicidade para as células (Kamini et al., 2018). O 1-naftol resultante transpórtase ao citoplasma a través da membrana interna por partición e/ou difusión, e despois é hidroxilado a 1,2-dihidroxinaftaleno polo encima de alta afinidade 1NH para un maior metabolismo na vía central do carbono.
Aínda que os microorganismos teñen as capacidades xenéticas e metabólicas para degradar as fontes de carbono xenobióticas, a estrutura xerárquica da súa utilización (é dicir, o uso preferencial de fontes de carbono simples sobre complexas) é un obstáculo importante para a biodegradación. A presenza e utilización de fontes de carbono simples regula á baixa os xenes que codifican encimas que degradan fontes de carbono complexas/non preferidas, como os HAP. Un exemplo ben estudado é que cando se lle administran glicosa e lactosa a Escherichia coli, a glicosa utilízase de forma máis eficiente que a lactosa (Jacob e Monod, 1965). Informouse de que Pseudomonas degrada unha variedade de HAP e compostos xenobióticos como fontes de carbono. A xerarquía da utilización de fontes de carbono en Pseudomonas é ácidos orgánicos > glicosa > compostos aromáticos (Hylemon e Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Non obstante, hai unha excepción. Curiosamente, Pseudomonas sp. A CSV86 exhibe unha estrutura xerárquica única que utiliza preferentemente hidrocarburos aromáticos (ácido benzoico, naftaleno, etc.) en lugar de glicosa e cometaboliza hidrocarburos aromáticos con ácidos orgánicos (Basu et al., 2006). Nesta bacteria, os xenes para a degradación e o transporte de hidrocarburos aromáticos non están regulados á baixa mesmo en presenza dunha segunda fonte de carbono como a glicosa ou os ácidos orgánicos. Cando se cultivaron en medio de glicosa e hidrocarburos aromáticos, observouse que os xenes para o transporte e o metabolismo da glicosa estaban regulados á baixa, os hidrocarburos aromáticos utilizáronse na primeira fase logarítmica e a glicosa utilizouse na segunda fase logarítmica (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Por outra banda, a presenza de ácidos orgánicos non afectou á expresión do metabolismo dos hidrocarburos aromáticos, polo que se espera que esta bacteria sexa unha cepa candidata para estudos de biodegradación (Phale et al., 2020).
É ben sabido que a biotransformación de hidrocarburos pode causar estrés oxidativo e regulación á alza dos encimas antioxidantes nos microorganismos. A biodegradación ineficiente do naftaleno, tanto en células de fase estacionaria como en presenza de compostos tóxicos, leva á formación de especies reactivas de osíxeno (ROS) (Kang et al. 2006). Dado que os encimas que degradan o naftaleno conteñen clústeres de ferro-xofre, baixo estrés oxidativo, o ferro no hemo e nas proteínas de ferro-xofre oxidarase, o que levará á inactivación das proteínas. A ferredoxina-NADP+ redutase (Fpr), xunto coa superóxido dismutase (SOD), media a reacción redox reversible entre NADP+/NADPH e dúas moléculas de ferredoxina ou flavodoxina, eliminando así as ROS e restaurando o centro de ferro-xofre baixo estrés oxidativo (Li et al. 2006). Informouse de que tanto a Fpr como a SodA (SOD) en Pseudomonas poden ser inducidas polo estrés oxidativo, e observouse un aumento das actividades de SOD e catalase en catro cepas de Pseudomonas (O1, W1, As1 e G1) durante o crecemento en condicións de adición de naftaleno (Kang et al., 2006). Os estudos demostraron que a adición de antioxidantes como o ácido ascórbico ou o ferro ferroso (Fe2+) pode aumentar a taxa de crecemento do naftaleno. Cando Rhodococcus erythropolis creceu en medio de naftaleno, aumentou a transcrición dos xenes do citocromo P450 relacionados co estrés oxidativo, incluíndo sodA (Fe/Mn superóxido dismutase), sodC (Cu/Zn superóxido dismutase) e recA (Sazykin et al., 2019). A análise proteómica cuantitativa comparativa de células de Pseudomonas cultivadas en naftaleno mostrou que a regulación á alza de varias proteínas asociadas coa resposta ao estrés oxidativo é unha estratexia de afrontamento do estrés (Herbst et al., 2013).
Informouse de que os microorganismos producen biosurfactantes baixo a acción de fontes de carbono hidrofóbicas. Estes surfactantes son compostos tensioactivos anfifílicos que poden formar agregados nas interfaces aceite-auga ou aire-auga. Isto promove a pseudosolubilización e facilita a adsorción de hidrocarburos aromáticos, o que resulta nunha biodegradación eficiente (Rahman et al., 2002). Debido a estas propiedades, os biosurfactantes úsanse amplamente en diversas industrias. A adición de surfactantes químicos ou biosurfactantes aos cultivos bacterianos pode mellorar a eficiencia e a velocidade da degradación dos hidrocarburos. Entre os biosurfactantes, os ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa foron amplamente estudados e caracterizados (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Ademais, outros tipos de biosurfactantes inclúen lipopéptidos (mucinas de Pseudomonas fluorescens), emulsionante 378 (de Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg e Ron, 1999), lípidos de disacárido de trehalosa de Rhodococcus (Ramdahl, 1985), liquenina de Bacillus (Saraswathy e Hallberg, 2002) e surfactante de Bacillus subtilis (Siegmund e Wagner, 1991) e Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Demostrouse que estes potentes surfactantes reducen a tensión superficial de 72 dinas/cm a menos de 30 dinas/cm, o que permite unha mellor absorción de hidrocarburos. Informouse de que Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia e outras especies bacterianas poden producir varios biosurfactantes baseados en ramnolípidos e glicólipidos cando se cultivan en medios de naftaleno e metilnaftaleno (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 pode producir o biosurfactante extracelular Biosur-Pm cando se cultiva en compostos aromáticos como o ácido naftoico (Phale et al., 1995). A cinética da formación de Biosur-Pm mostrou que a súa síntese é un proceso dependente do crecemento e do pH. Descubriuse que a cantidade de Biosur-Pm producida polas células a pH neutro era maior que a pH 8,5. As células cultivadas a pH 8,5 eran máis hidrófobas e tiñan maior afinidade polos compostos aromáticos e alifáticos que as células cultivadas a pH 7,0. En Rhodococcus spp. O N6, unha maior proporción de carbono en relación co nitróxeno (C:N) e a limitación do ferro son condicións óptimas para a produción de biosurfactantes extracelulares (Mutalik et al., 2008). Fixéronse intentos para mellorar a biosíntese de biosurfactantes (surfactinas) optimizando as cepas e a fermentación. Non obstante, o título de surfactante no medio de cultivo é baixo (1,0 g/L), o que supón un desafío para a produción a grande escala (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Polo tanto, utilizáronse métodos de enxeñaría xenética para mellorar a súa biosíntese. Non obstante, a súa modificación por enxeñaría é difícil debido ao gran tamaño do operón (∼25 kb) e á complexa regulación biosintética do sistema de detección de quórum (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Realizáronse varias modificacións de enxeñaría xenética nas bacterias Bacillus, principalmente co obxectivo de aumentar a produción de surfactina substituíndo o promotor (operón srfA), sobreexpresando a proteína de exportación de surfactina YerP e os factores reguladores ComX e PhrC (Jiao et al., 2017). Non obstante, estes métodos de enxeñaría xenética só conseguiron unha ou unhas poucas modificacións xenéticas e aínda non chegaron á produción comercial. Polo tanto, é necesario un estudo máis profundo dos métodos de optimización baseados no coñecemento.
Os estudos de biodegradación de HAP realízanse principalmente en condicións de laboratorio estándar. Non obstante, en lugares contaminados ou en ambientes contaminados, demostrouse que moitos factores abióticos e bióticos (temperatura, pH, osíxeno, dispoñibilidade de nutrientes, biodisponibilidade do substrato, outros xenobióticos, inhibición do produto final, etc.) alteran e inflúen na capacidade degradativa dos microorganismos.
A temperatura ten un efecto significativo na biodegradación dos HAP. A medida que a temperatura aumenta, a concentración de osíxeno disolto diminúe, o que afecta o metabolismo dos microorganismos aeróbicos, xa que requiren osíxeno molecular como un dos substratos para as oxixenases que levan a cabo reaccións de hidroxilación ou clivaxe do anel. Adoita observarse que unha temperatura elevada converte os HAP orixinais en compostos máis tóxicos, o que inhibe a biodegradación (Muller et al., 1998).
Observouse que moitos sitios contaminados con HAP teñen valores de pH extremos, como os sitios contaminados por drenaxe ácida de minas (pH 1–4) e os sitios de gasificación de gas natural/carbón contaminados con lixiviados alcalinos (pH 8–12). Estas condicións poden afectar gravemente o proceso de biodegradación. Polo tanto, antes de empregar microorganismos para a biorremediación, recoméndase axustar o pH engadindo produtos químicos axeitados (con potencial de oxidación-redución de moderado a moi baixo) como sulfato de amonio ou nitrato de amonio para solos alcalinos ou encalado con carbonato de calcio ou carbonato de magnesio para sitios ácidos (Bowlen et al. 1995; Gupta e Sar 2020).
O subministro de osíxeno á zona afectada é o factor limitante da velocidade da biodegradación dos HAP. Debido ás condicións redox do ambiente, os procesos de biorremediación in situ adoitan requirir a introdución de osíxeno procedente de fontes externas (labranza, burbulla de aire e adición de produtos químicos) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) demostraron que a adición de peróxido de magnesio (un composto liberador de osíxeno) a un acuífero contaminado podería biorremediar eficazmente os compostos BTEX. Outro estudo investigou a degradación in situ de fenol e BTEX nun acuífero contaminado inxectando nitrato de sodio e construíndo pozos de extracción para lograr unha biorremediación eficaz (Bewley e Webb, 2001).