Actual†Enderezo actual: OX11 0DE, Reino Unido, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Reino Unido, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
O complexo de captación de luz do centro de reacción 1 (RC-LH1) é o compoñente fotosintético central das bacterias fototróficas púrpuras. Introducimos dúas estruturas de criomicroscopía electrónica do complexo RC-LH1 de Rhodopseudomonas palustris. A estrutura de resolución de 2,65 Å do complexo RC-LH114-W consta de 14 bucles de subunidades LH1 que rodean RC, que está interrompido pola proteína W, mentres que o complexo sen proteína W ten unha composición RC completamente rodeada por RC. Bucle LH1 pechado de 16 subunidades. A comparación destas estruturas proporciona información sobre a dinámica da quinona no complexo RC-LH1, incluíndo cambios conformacionais previamente non determinados ao unirse á quinona no sitio QB de RC, así como a localización dos sitios auxiliares de unión de quinona, que axudan a pasalos a RC. A estrutura única da proteína W impide o peche do bucle LH1, creando así unha canle para acelerar o intercambio de quinona/quinolona.
A enerxía proporcionada pola fotosíntese pode sustentar case toda a vida na Terra e ten un gran potencial para a biotecnoloxía solar. Ao tempo que promoven a fotosíntese global, as bacterias fototróficas púrpuras tamén exhiben varios modos de enerxía e capacidades metabólicas. Poden evitar a fotosíntese e crecer como bacterias heterótrofas na escuridade, poden fixar nitróxeno e dióxido de carbono, producir hidróxeno e degradar compostos aromáticos (1-3). Para proporcionar enerxía para estes procesos, a luz debe converterse de forma rápida e eficiente en enerxía química. Este proceso comeza cando o complexo de antena que atrapa a luz absorbe a luz e transfire a enerxía atrapada ao centro de reacción (RC), iniciando así a separación de carga (4-7). A unidade básica da fotosíntese nas bacterias fototróficas púrpuras está composta por RC de tipo 2, rodeada polo complexo captador de luz 1 (LH1), formando o complexo central RC-LH1. O LH1 está formado por unha matriz de heterodímeros αβ curvos, cada un dos cales se une a dúas moléculas de clorofila bacteriana (BChl) a e a un ou dous carotenoides (8-12). A antena LH1 máis simple consta de 16 ou 17 heterodímeros αβ que rodean RC (9-13) nun bucle pechado, pero noutros complexos centrais, os péptidos transmembrana interrompen a continuidade do LH1 circundante, promovendo así a difusión de quinol/quinona entre RC e o complexo do citocromo bc1 (11, 13-15). A planta fototrófica púrpura Rhodopseudomonas (Rps.) é un organismo modelo que pode comprender a transferencia de enerxía e electróns que soporta a fotosíntese. A primeira estrutura cristalina de Rps. O modelo do complexo RC-LH1 palustris é RC, rodeado por 15 bucles LH1 heterodímeros, que están interrompidos por unha proteína descoñecida chamada "Proteína W" (14). A proteína W identificouse posteriormente como RPA4402, que é unha proteína non caracterizada de 10,5 kDa con tres hélices transmembrana (TMH) previstas (16). Propoñemos renomear o xene rpa4402 que codifica a proteína W a pufW para ser coherente coa nomenclatura empregada para os xenes que codifican as subunidades RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). Curiosamente, a proteína W só está presente en aproximadamente o 10 % da RC-LH1, o que revela que Rps. palustris produce dous complexos RC-LH1 diferentes. Aquí, presentamos as estruturas crio-EM (crio-EM) de alta resolución de dous complexos principais, un con proteína W e 14 heterodímeros αβ, o outro sen proteína W e un bucle LH1 pechado de 16 heterodímeros. A nosa estrutura representa un cambio radical na comprensión do complexo RC-LH1 de Rps. palustris, porque analizamos a poboación homoxénea de cada variante e temos unha resolución suficiente para asignar claramente cada péptido e os pigmentos unidos, así como os lípidos e quinonas relacionados. A comparación destas estruturas mostra que as tres proteínas TMH-W que non se atoparon en ningún outro complexo RC-LH1 ata o de agora xeran un canal de quinona para acelerar o intercambio de quinona/quinolona. Identificáronse varios sitios de unión de lípidos e quinonas conservados, e revelamos un novo cambio conformacional despois da combinación de quinona e RC, que pode ser axeitado para o RC do fotosistema II (PSII) de organismos fototróficos osixenados. Os nosos achados proporcionan novos coñecementos sobre a cinética da unión e o intercambio de quinona/quinolona no complexo central RC-LH1 das bacterias fototróficas púrpuras.
Para facilitar un estudo detallado dos dous complexos atopados en Rps. palustris, illámos cada RC-LH1 mediante métodos bioquímicos. O complexo deficiente en proteína W (en diante denominado ΔpufW) purificouse a partir da cepa que carecía do xene pufW (16) e só se pode producir un complexo RC-LH1. O complexo que contén a proteína W é producido por unha cepa. A proteína W desta cepa modifícase cunha etiqueta His 10x no seu extremo C-terminal, de xeito que o complexo que contén a proteína W se poida combinar eficazmente coa maioría das proteínas W que carecen mediante a inmobilización do metal. O complexo sepárase eficazmente (16) Cromatografía de afinidade (IMAC).
Como se mostra na Figura 1, ambos complexos conteñen un RC de tres subunidades (RC-L, RC-M e RC-H) rodeado por unha antena LH1. A estrutura de 2,80 Å do complexo que carece de proteína W mostra 16 heterodímeros αβ, formando un bucle LH1 pechado que rodea completamente a RC, en diante denominado complexo RC-LH116. A estrutura de 2,65 Å do complexo que contén a proteína W ten un LH1 de 14 heterodímeros interrompido pola proteína W, en diante denominado RC-LH114-W.
(A e B) Representación superficial do composto. (C e D) Pigmentos unidos expresados ​​en bastóns. (E e F) Os complexos observados desde a superficie citoplasmática teñen os péptidos e as subunidades LH1 representados en debuxos animados e están numerados no sentido das agullas do reloxo desde o oco da proteína W [coherente coa numeración Rba. Complexo sphaeroides (13)]. Para LH1-α, a cor da subunidade proteica é amarela; para LH1-β, a cor da subunidade proteica é azul; para RC-H, a proteína é vermella; para RC-H, é cian; para RC-L, é laranxa; para RC-M, maxenta. Os cofactores están representados por bastóns, o verde representa as moléculas de BChl e BPh a, o púrpura representa os carotenoides e o amarelo representa as moléculas de UQ10. (G e H) Vista ampliada do oco da proteína W na rexión equivalente do complexo RC-LH114-W (G) e do complexo RC-LH116 (H). Os cofactores móstranse en forma de recheo de espazo, a quinona quelada móstrase en azul. O espazo proteína-W está destacado por unha liña descontinua azul en (G), e os pequenos buratos onde a quinona/quinolol se difunde no anel LH116 están destacados por unha liña descontinua negra en (H).
A Figura 1 (A e B) mostra o RC rodeado por matrices abertas ou pechadas de heterodímeros LH1αβ, cada un dos cales se une a dous BChl e un carotenoide (Figura 1, C e D). Estudos previos demostraron que Rps é o complexo LH1. Na vía biosintética da xantina de espirulina, estas especies conteñen poboacións mixtas de carotenoides (17). Non obstante, a espiropirroxantina é o carotenoide dominante e a súa densidade é satisfactoria. Polo tanto, optamos por modelar a espiroxantina en todos os sitios de unión de LH1. Os polipéptidos alfa e beta son TMH individuais con rexións externas de membrana curtas (Figura 1, A, B, E e F). Aínda que non se observou a densidade de 17 residuos no extremo C-terminal, o polipéptido alfa foi clivado de Met1 a Ala46 en ambos complexos. O polipéptido β reduciuse de Gly4 a Tyr52 en RC-LH116 e de Ser5 a Tyr52 en RC-LH114-W. Non se observou ningunha densidade de 3 ou 4 residuos N-terminais nin 13 C-terminais (Figura S1). A análise por espectrometría de masas do complexo mixto RC-LH1 preparado a partir da cepa de tipo salvaxe mostrou que a rexión que faltaba era o resultado da clivaxe heteróloga destes péptidos (Figuras S1 e S2). Tamén se observou a formilación N-terminal de α-Met1 (f). A análise mostrou que o α-péptido consiste en residuos fMet1 a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, e o β-péptido consiste en residuos Ser2 a Ala53, o que concorda ben co mapa de densidade EM de baixa temperatura.
A coordinación de α-His29 e β-His36 fai que os BChls estean enfrontados; cada heterodímero αβ ensámese cos seus veciños para formar un bucle aberto (RC-LH114-W) ou un bucle pechado (RC-LH116) arredor da matriz de pigmentos acoplados a excitóns RC (Figura 1, C e D). En comparación coa banda de 877 nm de RC-LH114-W, o desprazamento cara ao vermello de absorción a 880 nm de RC-LH116 é de 3 nm (Figura 2A). Non obstante, o espectro de dicroísmo circular é case o mesmo (Figura 2B), o que indica que, aínda que hai unha clara diferenza entre os bucles abertos e pechados, o ambiente local dos BChls é moi similar. O desprazamento cara ao vermello de absorción pode ser o resultado dun movemento térmico reducido e unha maior estabilidade no bucle pechado (18, 19), o cambio no acoplamento dos pigmentos causado polo bucle pechado (20, 21) ou unha combinación destes dous efectos (11).
(A) Espectro de absorción ultravioleta/visible/infravermello próximo, cuxos picos están marcados cos seus pigmentos correspondentes e normalizados ao pico BPh a 775 nm. (B) Espectro de dicroísmo circular normalizado á absorbancia de BChl a 805 nm. (C e D) Espectros ΔA seleccionados dos espectros de absorción resoltos no tempo do complexo RC-LH114-W (C) e do complexo RC-LH116 (D). Para unha mellor comparabilidade, todos os espectros están normalizados a ∆A de −A a 0,2 ps. (E) A taxa de oxidación do citocromo c2 despois da irradiación en presenza de varias concentracións de UQ2 (véxase a Figura S8 para os datos brutos). (F) En células cultivadas baixo luz de baixa, media ou alta intensidade (10, 30 ou 300 μMm-2 s-1, respectivamente), as subunidades da proteína W e RC-L no complexo purificado e a proporción de membrana separada. Determinar o nivel de proteína mediante electroforese en xel de SDS-poliacrilamida e inmunoensaio (véxase a Figura S9 para os datos brutos). Determinar a proporción relativa ao complexo RC-LH114-W purificado. A proporción estequiométrica de RC-L a proteína-W do complexo é de 1:1.
Os BChls na posición 1 no bucle αβ14 deformado de RC-LH114-W (Figura 1, A, C e E) están máis preto do doante primario RC (P) en 6,8 Å que os BChls equivalentes en RC-LH116 (Figura 1, B, D e F, e Figura S3); non obstante, a cinética de absorción transitoria dos dous complexos mostra que para RC-LH114-W e RC-LH116, as constantes de tempo de transferencia de enerxía de excitación de LH1 a RC son 40 ±4 e 44 ±3 ps (Figura 2). , C e D, Figura S4 e Táboa S2). Tampouco hai unha diferenza significativa na transferencia electrónica dentro de RC (Figura S5 e texto complementario relacionado). Sospeitamos que a estreita correspondencia do tempo de transferencia de enerxía entre LH1 e RC-P débese á distancia, ángulo e enerxía potencial similares da maioría dos BChl nos dous bucles LH1. Parece que explorar o patrón de enerxía LH1 para alcanzar a distancia mínima non é máis rápido que a transferencia directa de enerxía desde sitios subóptimos a RC. O bucle LH1 de bucle aberto en RC-LH114-W tamén pode sufrir un movemento térmico insignificante en condicións de baixa temperatura para a análise estrutural, e hai unha conformación de anel αβ14 máis longa a temperatura ambiente a partir da distancia de pigmentación de βBChls na posición de RC 1.
O complexo RC-LH116 contén 32 BChls e 16 carotenoides, e a súa disposición xeral é a mesma que a obtida de Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 cepa (PDB ID 7C9R) (12) e algas verdes (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Despois do aliñamento, só se observaron pequenas desviacións nas posicións dos heterodímeros αβ, especialmente 1-5, 15 e 16 (Figura S6). A presenza da proteína W ten un impacto significativo na estrutura de LH1. Os seus tres TMH están conectados por bucles curtos, co N-terminal no lado do lume do complexo e o C-terminal no lado citoplasmático (Figuras 1A e 3, A a D). A proteína W é en gran parte hidrofóbica (Figura 3B), e TMH2 e TMH3 interactúan con LH1αβ-14 para formar unha superficie transmembrana (Figura 3, B e E a G). A interface está composta principalmente por residuos de Phe, Leu e Val na rexión transmembrana. Estes residuos están apilados con aminoácidos hidrofóbicos e pigmentos αβ-14. Algúns residuos polares tamén contribúen á interacción, incluíndo a ponte de hidróxeno entre W-Thr68 e β-Trp42 na superficie da cavidade complexa (Figura 3, F e G). Na superficie do citoplasma, Gln34 está adxacente ao grupo ceto dos carotenoides αβ-14. Ademais, a molécula de n-dodecil β-d-maltósido (β-DDM) resolveuse, e a súa cola hidrofóbica estendeuse ata a interface entre a proteína W e αβ-14, e a cola lipídica pode estar localizada no corpo. Tamén observamos que as rexións de resolución C-terminal da proteína W e RCH están moi próximas, pero non dentro do ámbito da formación de interaccións específicas (Figura 1, A e E). Non obstante, pode haber interaccións nos aminoácidos C-terminais non resoltos destas dúas proteínas, o que pode proporcionar un mecanismo para o recrutamento da proteína W durante a ensamblaxe do complexo RC-LH114-W.
(A) A proteína W, que mira cara á interface con LH1αβ14 en forma de debuxo animado, ten unha cadea lateral en forma de varilla (vermella), mostrada nunha parte do diagrama de potencial electrostático (superficie gris transparente cun nivel de contorno de 0,13). (B) A proteína W representada por unha superficie de cor hidrófoba. As áreas polares e cargadas móstranse en cian, as áreas hidrófobas móstranse en branco e as áreas fortemente hidrófobas móstranse en laranxa. (C e D) A proteína W representada en debuxo animado, a súa orientación é a mesma que en (A) (C) e rotada 180° (D). Segundo a posición na secuencia, os residuos distinguibles adoptan un esquema de cores arco da vella, onde o N-terminal é azul e o C-terminal é vermello. (E) A proteína W na mesma vista que en (A), e os residuos na interface proteína-W:LH1 están representados por varillas con marcas adxuntas. (F) A proteína W está rotada 90° en relación con (E) e LH1αβ14 na representación de debuxos animados e en relación cos residuos da interface na representación de barras. Os residuos sobresaíntes do polipéptido beta están etiquetados. O cofactor móstrase como unha barra que coincide coa cor da Figura 1, o β-DDM descomposto móstrase en gris e o osíxeno en vermello. (G) A vista en (F) está rotada 180°, cos residuos prominentes do polipéptido alfa etiquetado.
A proteína W substitúe un heterodímero αβ (o 15º na Figura 1F), o que impide o peche do bucle e a inclinación dos tres primeiros heterodímeros αβ. Observouse que o ángulo de inclinación máximo do primeiro heterodímero αβ-1 en relación coa normal da película era de 25° a 29° (Figura 1, A e E), que se formou pola inclinación de 2° a 8° de αβ-1 en RC Un contraste nítido-LH116 (Figura 1, B e F). O segundo e o terceiro heterodímero están inclinados de 12° a 22° e de 5° a 10°, respectivamente. Debido ao impedimento estérico de RC, a inclinación de αβ-1 non inclúe o segundo par de αβ (que corresponde ao 16º αβ na Figura 1F), formando así un oco claro no anel LH1 (Figura 1, A e E). Debido á falta de dous heterodímeros αβ, acompañada da perda de catro BChl e dous carotenoides, ningún dos carotenoides se une á subunidade αβ-1 retorcida, o que resulta nun anel LH114-W que contén 13 carotenoides vexetarianos e 28 BChls. As estimacións de resolución local dos dous complexos nas rexións αβ1 a 7 son inferiores ás do resto do bucle LH1, o que pode reflectir a plasticidade inherente da subunidade LH1 adxacente ao sitio RC QB (Figura 4).
As imaxes de RC-LH114-W (A e B) e RC-LH116 (C e D) móstranse desde a mesma vista superior/lateral (A e B) (A e C) e superficie da cavidade da figura 1 (B e D). As teclas de cores móstranse á dereita.
O único outro complexo central característico cunha proporción estequiométrica de 1:14 é o dímero RC-LH1-PufX de Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Non obstante, a proteína W e PufX non teñen unha homoloxía obvia e teñen un impacto significativo nas súas respectivas estruturas LH1. PufX é un único TMH cun dominio citoplasmático N-terminal que interactúa co lado citoplasmático da subunidade RC-H (13) nunha posición correspondente a Rps. palustris LH116αβ-16. PufX crea un canal para o intercambio de quinona/quinolona entre RC-LH1 e o complexo do citocromo bcl e está presente en todos os complexos centrais de Rba. sphaeroides (13). Aínda que a interface monómero-monómero está en Rba. O dímero sphaeroides RC-LH1-PufX está situado na posición de unión da proteína W en RC-LH114-W, e a brecha inducida por PufX e a proteína W está nunha posición equivalente (Figura S7A). A brecha en RC-LH114-W tamén está aliñada co hipotético canal de quinona (8) de Pseudomonas rosea LH1, que está formado por péptidos non relacionados coa proteína W ou PufX (Figura S7B). Ademais, o canal de quinona en Blc. O LH1 verde esmeralda formado ao excluír unha subunidade γ (7) está situado nunha posición similar (Figura S7C). Aínda que mediado por diferentes proteínas, a aparición destes canais de quinona/quinolol nunha posición común no complexo RC-LH1 parece ser un exemplo de evolución converxente, o que indica que a brecha creada pola proteína W pode actuar como un canal de quinona.
A fenda no bucle LH114-W permite a formación dunha rexión de membrana continua entre o espazo interno do complexo RC-LH114-W e a membrana a granel (Figura 1G), en lugar de conectar os dous dominios a través dun poro proteico como nas proteínas. O complexo RC-LH116 é similar a un complexo pechado en forma de agulla de Tch. (22) (Figura 1H). Dado que a difusión da quinona a través da membrana é máis rápida que a difusión a través do canal proteico estreito, o bucle aberto LH114-W pode permitir unha renovación máis rápida do RC que o bucle pechado LH116, e a difusión da quinona no RC pode ser máis restrinxida. Para comprobar se a proteína W afecta á conversión de quinonas a través do RC, realizamos un ensaio de oxidación do citocromo nunha determinada concentración de ubiquinona 2 (UQ2) (un análogo do UQ10 natural cunha cola de isopreno máis curta) (Figura 2E). Aínda que a presenza de quinona quelada dificulta a determinación precisa da constante aparente de Michaelis (RC-LH114-W e RC-LH116 son axeitados para 0,2 ± 0,1 μM e 0,5 ± 0,2 μM, respectivamente), a taxa máxima de RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) é un 28 ± 5 % maior que a de RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Inicialmente estimamos que a proteína W está presente en aproximadamente o 10 % do complexo central (16); aquí, as taxas de ocupación das células de crecemento con pouca luz, media luz e alta luz son do 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % e 0,9 ± 0,5 %, respectivamente (Figura 2F). A comparación cuantitativa da espectrometría de masas mostrou que a adición da etiqueta de histidina non reduciu a abundancia relativa da proteína W en comparación coas cepas de tipo salvaxe (P = 0,59), polo que estes niveis non son un artefacto da proteína W modificada (Figura S10). Non obstante, esta baixa ocupación da proteína W no complexo RC-LH1 pode permitir que algunhas RC se invertan a un ritmo acelerado, mitigando así o intercambio máis lento de quinona/quinolona no complexo RC-LH116. Observamos que a alta taxa de ocupación da luz é inconsistente cos datos transcriptómicos recentes, o que indica que a expresión do xene pufW aumenta baixo luz forte (Figura S11) (23). A diferenza entre a transcrición de pufW e a incorporación de proteína W no complexo RC-LH1 é confusa e pode reflectir a complexa regulación da proteína.
En RC-LH114-W, asígnanse e modelanse 6 moléculas de cardiolipina (CDL), 7 de fosfatidilcolina (POPC), 1 de fosfatidilglicerol (POPG) e 29 de β-DDM: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG e 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A e B). Nestas dúas estruturas, a CDL está case situada no lado citoplasmático do complexo, mentres que a POPC, a POPG e a β-DDM están situadas principalmente no lado luminal. Illáronse dúas moléculas de lípido e deterxente na rexión αβ-1 a αβ-6 do complexo RC-LH114-W (Figura 5A), e cinco illáronse na rexión equivalente de RC-LH116 (Figura 5B). Atopáronse máis lípidos no outro lado do complexo, principalmente CDL, acumuladas entre RC e αβ-7 a αβ-13 (Figura 5, A e B). Outros lípidos e deterxentes estruturalmente resoltos están situados fóra do anel LH1, e as cadeas acilo ben resoltas esténdense entre as subunidades LH1, designadas provisionalmente como β-DDM en RC-LH114-W e definidas como β-DDM en RC Unha mestura de β-DDM e POPC-LH116. As posicións similares dos lípidos e deterxentes quelantes na nosa estrutura indican que son sitios de unión fisioloxicamente relevantes (Figura S12A). As posicións das moléculas equivalentes en Tch tamén teñen boa consistencia. As cepas suaves e Trv. 970 RC-LH1 (Figura S12, B a E) (9, 12) e os residuos de enlace de hidróxeno do grupo da cabeza lipídica mostraron unha conservación bastante boa no aliñamento de secuencias (Figura S13), o que indica que a CDL conservada que se une a RC (24), estes sitios poden estar conservados no complexo RC-LH1.
(A e B) Os péptidos RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) represéntanse mediante debuxos animados, e os pigmentos mediante bastóns, usando o esquema de cores da Figura 1. Os lípidos móstranse en vermello e os deterxentes en gris. A UQ unida aos sitios RC QA e QB é amarela, mentres que a UQ illada é azul. (C e D) As mesmas vistas que (A) e (B), cos lípidos omitidos. (E a ​​G) Vista ampliada de Q1(E), Q2(F) e Q3(G) de RC-LH116, con cadeas laterais que se inflúen mutuamente. As pontes de hidróxeno móstranse como liñas negras descontinuas.
En RC-LH116, tanto RC QA como QB UQ, que participan na transferencia de electróns no proceso de separación de carga, están descompostos nos seus sitios de unión. Non obstante, en RC-LH114-W, a quinona QB non se resolveu e será discutida en detalle a continuación. Ademais das quinonas QA e QB, dúas moléculas UQ queladas (situadas entre os aneis RC e LH1) están asignadas na estrutura RC-LH114-W segundo os seus grupos de cabeza ben resoltos (situados en Q1 e Q2, respectivamente). espazo). Figura 5C). Dúas unidades de isopreno están asignadas a Q1, e o mapa de densidade resolve as 10 colas de isopreno completas de Q2. Na estrutura de RC-LH116, resolvéronse tres moléculas UQ10 queladas (Q1 a Q3, Figura 5D), e todas as moléculas teñen unha densidade clara en toda a cola (Figura 5, D a G). Nas dúas estruturas, as posicións dos grupos da cabeza de quinona de Q1 e Q2 teñen unha consistencia excelente (Figura S12F) e só interactúan con RC. Q1 está situado na entrada do espazo W de RC-LH114-W (Figura 1G e 5, C, D e E) e Q2 está situado preto do sitio de unión de QB (Figura 5, C, D) e F). Os residuos conservados de L-Trp143 e L-Trp269 están moi preto de Q1 e Q2 e proporcionan posibles interaccións de apilamento π (Figura 5, E e F, e Figura S12). L-Gln88, a 3,0 Å do osíxeno distal de Q1, proporciona unha forte ponte de hidróxeno (Figura 5E); este residuo consérvase en todos os RC excepto na relación máis distante (Figura S13). A L-Ser91 substitúese conservativamente por Thr na maioría das outras RC (Figura S13), está a 3,8 Å do osíxeno metilo de Q1 e pode proporcionar enlaces de hidróxeno débiles (Figura 5E). Q3 non parece ter unha interacción específica, pero está situada na rexión hidrofóbica entre a subunidade RC-M e a subunidade LH1-α 5 a 6 (Figura 5, D e G). Q1, Q2 e Q3 ou quinonas queladas próximas tamén se resolveron en Tch. Gentle, Trv. Strain 970 e Blc. A estrutura do iris (9, 10, 12) apunta a un sitio de unión de quinona auxiliar conservado no complexo RC-LH1 (Figura S12G). As cinco UQ descompostas en RC-LH116 concordan ben co 5,8 ± 0,7 de cada complexo determinado por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), mentres que as tres UQ descompostas en RC-LH114-W son inferiores a O valor medido de 6,2 ± 0,3 (Fig. S14) indica que hai moléculas de UQ sen resolver na estrutura.
Os polipéptidos pseudosimétricos L e M conteñen cada un cinco TMH e forman un heterodímero que combina un dímero de BChl, dous monómeros de BChl, dous monómeros de bacteriófago (BPh) e un ferro non hemo e unha ou dúas moléculas de UQ10. Debido á presenza de pontes de hidróxeno no grupo cetona terminal e á súa coñecida acumulación en Rps, os carotenoides incorpóranse na subunidade M, que se denomina cis-3,4-deshidroorhodopina. Especie (25). O dominio da membrana externa de RC-H está ancorado á membrana por un único TMH. A estrutura xeral de RC é similar á de tres subunidades RC de especies relacionadas (como Rba). sphaeroides (ID do PDB: 3I4D). Os macrociclos de BChl e BPh, a cadea principal dos carotenoides e o ferro non hemo solapanse dentro do rango de resolución destas estruturas, do mesmo xeito que o grupo principal UQ10 no sitio QA e a quinona QB en RC-LH116 (Figura S15).
A dispoñibilidade de dúas estruturas RC con diferentes taxas de ocupación de sitios QB ofrece unha nova oportunidade para examinar os cambios conformacionais consistentes que acompañan á unión da quinona QB. No complexo RC-LH116, a quinona QB está situada na posición "proximal" totalmente unida (26), pero a separación de RC-LH114-W non ten quinona QB. Non hai quinona QB en RC-LH114-W, o que é sorprendente porque o complexo é activo, máis que o complexo RC-LH116 con quinona QB estruturalmente resolta. Aínda que os dous aneis LH1 quelan unhas seis quinonas, cinco están estruturalmente resoltas no anel RC-LH116 pechado, mentres que só tres están estruturalmente limitadas no anel RC-LH114-W aberto. Este aumento da desorde estrutural pode reflectir a substitución máis rápida dos sitios QB RC-LH114-W, unha cinética máis rápida da quinona no complexo e unha maior probabilidade de cruzar o bucle LH1. Suxerimos que a falta de UQ no sitio RC QB de RC-LH114-W pode ser o resultado dun complexo máis complexo e máis activo, e que o sitio QB de RC-LH114-W quedou conxelado inmediatamente na renovación de UQ. A etapa específica (a entrada ao sitio QB foi pechada) reflicte a conformación desta actividade.
Sen QB, a rotación acompañante de L-Phe217 a unha posición incompatible coa unión de UQ10, porque causará unha colisión espacial coa primeira unidade de isopreno da cola (Figura 6A). Ademais, os principais cambios conformacionais obvios son evidentes, especialmente a hélice de (hélice curta no bucle entre TMH D e E) onde L-Phe217 se despraza ao peto de unión de QB e a rotación de L-Tyr223 (Figura 6A) para romper a ponte de hidróxeno co marco M-Asp45 e pechar a entrada do sitio de unión de QB (Figura 6B). A hélice de pivota na súa base, o Cα de L-Ser209 desprázase 0,33 Å, mentres que o L-Val221Cα se despraza 3,52 Å. Non hai cambios observables en TMH D e E, que son superpoñibles en ambas estruturas (Figura 6A). Polo que sabemos, esta é a primeira estrutura na RC natural que pecha o sitio QB. Unha comparación coa estrutura completa (unida a QB) mostra que antes de que a quinona se reduza, é necesario un cambio conformacional para que entre na quinona. L-Phe217 rota para formar unha interacción de apilamento π co grupo da cabeza da quinona, e a hélice desprázase cara a fóra, o que permite que o esqueleto de L-Gly222 e a cadea lateral de L-Tyr223 formen unha rede de enlaces de hidróxeno cunha estrutura de enlaces de hidróxeno estable (Figura 6, A e C).
(A) Debuxo animado superposto dun holograma (cadea L, cadea laranxa/M, maxenta) e unha estrutura apo (gris), na que os residuos clave se mostran en forma de representación en forma de vara. A UQ10 está representada por unha barra amarela. A liña punteada indica as pontes de hidróxeno formadas en toda a estrutura. (B e C) Representación superficial da apolipoproteína e toda a estrutura do anel, destacando o osíxeno da cadea lateral de L-Phe217 en azul e L-Tyr223 en vermello, respectivamente. A subunidade L é laranxa; as subunidades M e H non están coloreadas. (D e E) Apolipoproteína (D) e sitios RC QB completos (E) [coloreados por (A) respectivamente] e PSII de Thermophilus thermophilus (verde, azul con quinona plástica; ID do PDB: 3WU2) Aliñado (58).
Inesperadamente, aínda que existen varias estruturas de células radicais con deficiencia de QB sen LH1, os cambios conformacionais observados neste estudo non foran descritos previamente. Estes inclúen a estrutura de depleción de QB de Blc. viridis (ID do PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID do PDB: 1EYS) (28) e Rba. sphaeroides (ID do PDB: 1OGV) (29), todos eles case iguais á súa estrutura QB xeral. Unha inspección detallada do 3PRC revelou que as moléculas de deterxente LDAO (óxido de lauril dimetilamina) únense á entrada da posición QB, o que pode impedir o rearranxo nunha conformación pechada. Aínda que o LDAO non se descompón na mesma posición en 1EYS ou 1OGV, estes RC prepáranse usando o mesmo deterxente e, polo tanto, poden producir o mesmo efecto. A estrutura cristalina do Rba. O RC de Sphaeroides cocristalizado con citocromo c2 (ID do PDB: 1L9B) tamén parece ter un sitio QB pechado. Non obstante, neste caso, a rexión N-terminal do polipéptido RC-M (que interactúa co sitio de unión QB a través do enlace H do residuo Tyr na hélice Q) adopta unha conformación pouco natural, e o cambio conformacional QB non se explora máis (30). O que resulta tranquilizador é que non vimos este tipo de deformación do polipéptido M na estrutura RC-LH114-W, que é case a mesma que a rexión N-terminal do RC RC-LH116. Tamén cómpre sinalar que, tras a erradicación da antena LH1 baseada en deterxentes, os RC de apolipoproteína no PDB resolvéronse, o que eliminou os conxuntos internos de quinona e os lípidos no espazo entre o RC e a superficie interna do anel LH1 circundante (31, 32). A RC permanece funcional porque conserva todos os cofactores, agás a quinona QB descompoñible, que é menos estable e a miúdo se perde durante o proceso de preparación (33). Ademais, sábese que a eliminación de LH1 e lípidos cíclicos naturais da RC pode ter un impacto nas funcións, como a vida útil máis curta do estado P+QB separado por cargas (31, 34, 35). Polo tanto, especulamos que a existencia do anel LH1 local que rodea a RC pode manter o sitio QB "pechado", preservando así o ambiente local preto do QB.
Aínda que a apolipoproteína (sen quinona QB) e a estrutura completa representan só dúas instantáneas da renovación do sitio QB, en lugar dunha serie de eventos, hai indicios de que a unión pode ser regulada para evitar a reunión por hidroquinona para inhibir a inhibición do substrato. A interacción do quinolol e a quinona preto do sitio QB da apolipoproteína pode ser diferente, o que leva ao seu rexeitamento pola RC. Propúxose desde hai tempo que os cambios conformacionais xogan un papel na unión e redución das quinonas. A capacidade das RC conxeladas para reducir as quinonas despois da adaptación á escuridade vese afectada (36); a cristalografía de raios X mostra que este dano débese a que as quinonas QB están atrapadas nunha conformación "distal" a uns 4,5 Å da posición proximal activa (26), 37). Suxerimos que esta conformación de unión distal é unha instantánea do estado intermedio entre a apolipoproteína e a estrutura do anel completo, que segue á interacción inicial coa quinona e á apertura do sitio QB.
A RC de tipo II que se atopa no complexo PSII de certas bacterias e cianobacterias fotótrofas, algas e plantas presenta conservación estrutural e funcional (38). O aliñamento estrutural que se mostra na Figura 6 (D e E) enfatiza a semellanza entre as RC de PSII e o sitio QB do complexo RC bacteriano. Esta comparación foi durante moito tempo un modelo para estudar os sistemas estreitamente relacionados de unión e redución de quinonas. Publicacións anteriores suxeriron que os cambios conformacionais van acompañados da redución de PSII de quinonas (39, 40). Polo tanto, considerando a conservación evolutiva da RC, este mecanismo de unión non observado previamente tamén pode ser aplicable ao sitio QB da RC de PSII en plantas fotótrofas osixenadas.
As cepas Rps ΔpufW (deleción de pufW sen etiquetar) e PufW-His (proteína W etiquetada con His 10x no extremo C-terminal expresada a partir do locus natural de pufW). palustris CGA009 foi descrita no noso traballo anterior (16). Estas cepas e o proxenitor isoxénico de tipo salvaxe recuperáronse do conxelador mediante o sementado dun pequeno número de células nunha placa PYE (cada unha de 5 g litro -1) (almacenada en LB a -80 °C, que contiña un 50 % (p/v) de proteína (glicerol), extracto de lévedo e ágar (succinato) [1,5 % (p/v)]. A placa incubouse durante a noite na escuridade a temperatura ambiente en condicións anaeróbicas e, a continuación, iluminouse con luz branca (~50 μmolm -2 s -1) proporcionada por lámpadas halóxenas OSRAM de 116 W (RS Components, Reino Unido) durante 3 a 5 días ata que apareceu unha soa colonia. Usouse unha única colonia para inocular 10 ml de medio M22+ (41) suplementado con 0,1 % (p/v) de casaminoácidos (en diante denominado M22). O cultivo medrou en condicións de baixo contido de osíxeno na escuridade a 34 °C con axitación a 180 rpm durante 48 horas e, a continuación, inoculáronse 70 ml do cultivo nas mesmas condicións durante 24 horas. Utilizouse un cultivo semiaeróbico cun volume de 1 ml para inocular 30 ml de medio M22 nun frasco de vidro transparente con tapón de rosca universal de 30 ml e irradiouse con axitación (~50 μmolm-2 s-1) durante 48 horas mediante unha varilla de axitación magnética estéril. A continuación, inoculáronse 30 ml do cultivo con aproximadamente 1 litro de cultivo nas mesmas condicións, que logo se utilizou para inocular uns 9 litros de cultivo iluminado a ~200 μmolm-2 s-1 durante 72 horas. As células recolléronse por centrifugación a 7132 RCF durante 30 minutos, resuspendiéronse en ~10 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e almacenáronse a -20 °C ata que fosen necesarias.
Despois de desconxelar, engádense algúns cristais de desoxirribonuclease I (Merck, Reino Unido), lisozima (Merck, Reino Unido) e dous comprimidos inhibidores da protease da holoenzima Roche (Merck, Reino Unido) ás células resuspendidas. Nunha cela de presión francesa de 20 000 psi (Aminco, EUA), as células foron interrompidas de 8 a 12 veces. Despois de eliminar as células non rotas e os restos insolubles mediante centrifugación a 18 500 RCF durante 15 minutos a 4 °C, a membrana precipitouse a partir do lisado pigmentado mediante centrifugación a 113 000 RCF durante 2 horas a 43 000 °C. Desbota a fracción soluble e resuspenda a membrana coloreada en 100 a 200 ml de tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e homoxeneízaa ata que non haxa agregados visibles. A membrana suspendida incubouse en tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, EUA) que contiña β-DDM ao 2 % (p/v) durante 1 hora na escuridade a 4 °C con axitación suave. Despois, centrifugouse a 70 °C para disolver 150 000 RCF a 4 °C durante 1 hora para eliminar os insolubles residuais.
A membrana solubilizante da cepa ΔpufW aplicouse a unha columna de intercambio iónico DEAE Sepharose de 50 ml con tres volumes de columna (CV) de tampón de unión [20 mM de tris-HCl (pH 8,0) que contiña 0,03 % (p/v) de β-DDM]. Lavar a columna con dous tampóns de unión CV e, a continuación, lavar a columna con dous tampóns de unión que contiñan 50 mM de NaCl. O complexo RC-LH116 eluíuse cun gradiente lineal de 150 a 300 mM de NaCl (en tampón de unión) a 1,75 CV e o complexo de unión restante eluíuse cun tampón de unión que contiña 300 mM de NaCl a 0,5 CV. Recoller o espectro de absorción entre 250 e 1000 nm, manter a fracción cunha relación de absorbancia (A880/A280) superior a 1 a 880 a 280 nm, diluír dúas veces no tampón de unión e usar o mesmo procedemento de novo na columna DEAE na purificación. Diluír as fraccións con relacións A880/A280 superiores a 1,7 e relacións A880/A805 superiores a 3,0, realizar a terceira rolda de intercambio iónico e conservar as fraccións con relacións A880/A280 superiores a 2,2 e relacións A880/A805 superiores a 5,0. O complexo parcialmente purificado concentrouse a ~2 ml nun filtro centrífugo Amicon con límite de peso molecular (MWCO) de 100.000 (Merck, Reino Unido) e cargouse nunha columna de exclusión por tamaño Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, EUA) que contiña 200 mM de tampón de NaCl e, a continuación, eluíuse no mesmo tampón a 1,5 CV. Recoller os espectros de absorción da fracción de exclusión por tamaño e concentrar os espectros de absorción con proporcións A880/A280 superiores a 2,4 e proporcións A880/A805 superiores a 5,8 a 100 A880 e úsaos inmediatamente para a preparación ou almacenamento da grella crio-TEM. Manter a -80 °C ata que sexa necesario.
A membrana solubilizante da cepa PufW-His aplicouse a unha columna de sefarosa HisPrep FF Ni-NTA de 20 ml (20 mM de tris-HCl (pH 8,0) que contiña 200 mM de NaCl e 0,03 % (p/p)) en tampón IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. A columna lavouse con cinco ciclos vitais de tampón IMAC e, a seguir, con cinco ciclos vitais de tampón IMAC que contiñan 10 mM de histidina. O complexo central eluíuse da columna con cinco tampóns IMAC que contiñan 100 mM de histidina. A fracción que contén o complexo RC-LH114-W concéntrase a ~10 ml nun tanque con axitación equipado cun filtro Amicon 100.000 MWCO (Merck, Reino Unido), dilúese 20 veces con tampón de unión e, a seguir, engádese a 25 ml. Na columna de sefarosa DEAE, utilízanse previamente catro ciclos vitais unidos ao tampón. Lavar a columna con catro tampóns de unión CV, despois eluír o complexo en oito CV nun gradiente lineal de 0 a 100 mM de NaCl (en tampón de unión) e os catro CV restantes conteñen 100 mM de tampón de unión. Os complexos residuais eluídos no cloruro de sodio combinado coa proporción A880/A280 superior a 2,4 e a proporción A880/A805 superior a 4,6. As fraccións concentráronse a ~2 ml nun filtro centrífugo Amicon de 100.000 MWCO e enchíronse con IMAC de 1,5 CV en columna de exclusión de tamaño Superdex 200 16/600 equilibrada con tampón previo e despois eluíronse no mesmo tampón a máis de 1,5 CV. Recoller os espectros de absorción das fraccións de exclusión por tamaño e concentrar os espectros de absorción con proporcións A880/A280 superiores a 2,1 e proporcións A880/A805 superiores a 4,6 a 100 A880, que se usan inmediatamente para a preparación da grella TEM conxelada ou se almacenan a -80 °C ata que sexan necesarios.
Empregouse un conxelador de inmersión Leica EM GP para preparar as grellas TEM de baixa temperatura. O complexo diluíuse en tampón IMAC ata A880 de 50 e, a continuación, cargáronse 5 μl nunha malla de cobre recuberta de carbono QUANTIFOIL 1.2/1.3 recentemente descargada por lumen (Agar Scientific, Reino Unido). Incubar a grella a 20 °C e 60 % de humidade relativa durante 30 s, despois secala durante 3 s e, a continuación, arrefríaa en etano líquido a -176 °C.
Os datos do complexo RC-LH114-W rexistráronse no eBIC (Electronic Biomaging Center) (British Diamond Light Source) cun microscopio Titan Krios, que funciona a unha tensión de aceleración de 300 kV, cun aumento nominal de 130.000× e unha enerxía de -. Escolle un intervalo de 20 eV. Empregouse un Gatan 968 GIF Quantum con detector de picos K2 para rexistrar imaxes en modo de contaxe para recoller datos. O tamaño de píxel calibrado é de 1,048 Å e a taxa de dose é de 3,83 e-Å-2s-1. Recolleuse a película en 11 segundos e dividiuna en 40 partes. Use a área recuberta de carbono para reenfocar o microscopio e, a continuación, recolla tres películas por burato. En total, recolléronse 3130 películas, con valores de desenfoque entre -1 e -3 μm.
Os datos do complexo RC-LH116 recolléronse empregando o mesmo microscopio no Laboratorio de Bioestruturas de Asterbury (Universidade de Leeds, Reino Unido). Os datos recolléronse en modo de contaxe cun aumento de 130 k e o tamaño do píxel calibrouse a 1,065 Å cunha dose de 4,6 e-Å-2s-1. A película gravouse en 12 segundos e dividiuse en 48 partes. En total, recolléronse 3359 películas, con valores de desenfoque entre -1 e -3 μm.
Todo o procesamento de datos realízase na canle Relion 3.0 (42). Emprega Motioncorr 2 (43) para corrixir o movemento do feixe mediante a ponderación da dose e, a seguir, usa CTFFIND 4.1 (44) para determinar o parámetro CTF (función de transferencia de contraste). As microfotografías típicas despois destas etapas iniciais de procesamento móstranse na Figura 2. S16. O modelo de selección automática xérase seleccionando manualmente uns 250 píxeles de 1000 partículas nun fotograma de 250 píxeles e sen clasificación bidimensional (2D) de referencia, rexeitando así aquelas clasificacións que se atopan con contaminación da mostra ou que non teñen características discernibles. Despois, realizouse a selección automática en todas as microfotografías e o RC-LH114-W tiña 849.359 partículas e o complexo RC-LH116 tiña 476.547 partículas. Todas as partículas seleccionadas sometéronse a dúas roldas de clasificación 2D sen referencia e, despois de cada execución, rexeitanse as partículas que coinciden coa área de carbono, a contaminación da mostra, sen características obvias ou partículas con forte superposición, o que resulta en 772.033 (90,9 %) e 359.678 (75,5 %) partículas. As partículas utilízanse para a clasificación 3D de RC-LH114-W e RC-LH116, respectivamente. O modelo de referencia 3D inicial xerouse mediante o método de descenso de gradiente estocástico. Usando o modelo inicial como referencia, as partículas seleccionadas clasifícanse en catro categorías en 3D. Usando o modelo desta categoría como referencia, realízase un refinamento 3D nas partículas da categoría máis grande e, a continuación, use o filtro de paso baixo inicial de 15 Å para cubrir a área do solvente, engada 6 píxeles de bordos suaves e posprocese os píxeles para corrixir a función de transferencia de modulación de pico de Gatan K2 do detector superior. Para o conxunto de datos RC-LH114-W, este modelo inicial modificouse eliminando a forte densidade nos bordos da máscara (desconectada da densidade complexa do núcleo en UCSF Chimera). Os modelos resultantes (as resolucións de RC-LH114-W e RC-LH116 son 3,91 e 4,16 Å, respectivamente) utilízanse como referencia para a segunda rolda de clasificación 3D. As partículas utilizadas agrúpanse na clase 3D inicial e non conteñen unha forte correlación coa veciñanza. Superposición ou falta de características estruturais obvias. Despois da segunda rolda de clasificación 3D, seleccionouse a categoría coa maior resolución [Para RC-LH114-W, unha categoría é de 377.703 partículas (44,5%), para RC-LH116, hai dúas categorías, que suman un total de 260.752 partículas (54,7%), onde son iguais só cando están aliñadas despois da rotación inicial cunha pequena diferenza]. As partículas seleccionadas reextraense nunha caixa de 400 píxeles e refínanse mediante refinamento 3D. A máscara de solvente xérase usando o filtro de paso baixo inicial de 15 Å, a expansión do mapa de 3 píxeles e a máscara suave de 3 píxeles. Usando o refinamento CTF por partícula, a corrección do movemento por partícula e a segunda rolda de refinamento CTF por partícula, o refinamento 3D, o enmascaramento de solvente e o posprocesamento realízanse despois de cada paso para refinar aínda máis a textura resultante. Usando o valor de corte FSC (coeficiente de correlación de capa de Fourier) de 0,143, as resolucións dos modelos finais de RC-LH114-W e RC-LH116 son 2,65 e 2,80 Å, respectivamente. A curva FSC do modelo final móstrase na Figura 2. S17.
Todas as secuencias de proteínas descargáronse de UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) utilizouse para construír un modelo de homoloxía de RC, que contén as secuencias de proteínas de RC-L, RC-M e RC-H e a estrutura cristalina de Rba. sphaeroides RC utilizouse como molde (PDB ID: 5LSE) (46). Emprega a ferramenta "mapa de axuste" en UCSF Chimera para axustar o modelo xerado ao mapa (47), mellorar a estrutura da proteína e engadir o cofactor [4×BChl a (nome do residuo da biblioteca de monómeros = BCL), 2×BPh a (BPH), un ou dous tipos de UQ10 (U10), un ferro non hemo (Fe) e unha 3,4-dihidrohexacarbonilcolina (QAK)] usando Coot (48). Dado que QAK non está dispoñible na biblioteca de monómeros, parametrizouse usando a ferramenta eLBOW en PHENIX (49).
A continuación, construíuse a subunidade LH1. Inicialmente, utilizouse a ferramenta de construción automática en PHENIX (49) para construír automaticamente parte da secuencia LH1 usando o mapa e as secuencias de proteínas LH1-α e LH1-β como entrada. Seleccione a subunidade LH1 máis completa, extráiaa e cárguea en Coot, engada manualmente a secuencia que falta nela e refine manualmente toda a estrutura antes de engadir dous BCl a (BCL) e unha espiriloxantina (CRT) [segundo as Rps relevantes. A densidade do complexo LH1 e o contido de carotenoides coñecido. Especies (17)]. Copie a subunidade LH1 completa e use a ferramenta "Docking Map Tool" de UCSF Chimera para acoplar na área adxacente non modelo da densidade LH1 e logo refinea en Coot; repita o proceso ata que todas as subunidades LH1 sexan modeladas. Para a estrutura RC-LH114-W, ao extraer a densidade non asignada en Coot, a proteína segméntase dos compoñentes non proteicos restantes no mapa de quimeras USCF e úsase a ferramenta de construción automática para establecer o modelo inicial e a modelización das subunidades restantes (proteína-W). En PHENIX (49). Engade calquera secuencia que falte ao modelo resultante en Coot (48) e, a seguir, refina manualmente toda a subunidade. A densidade non asignada restante axústase á combinación de lípidos (ID da biblioteca de monómeros PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), deterxente β-DDM (LMT) e moléculas UQ10 (U10). Usa a optimización de PHENIX (49) e a optimización manual en Coot (48) para perfeccionar o modelo inicial completo ata que as estatísticas do modelo e a calidade visual do axuste non se poidan mellorar aínda máis. Finalmente, usa LocScale (50) para definir mellor o mapa local e, a seguir, realiza varios ciclos máis de modelización da densidade non asignada e optimización automática e manual.
Os respectivos péptidos, cofactores e outros lípidos e quinonas acoplados dentro das súas respectivas densidades móstranse nas figuras 1 e 2, S18 a S23. A información estatística do modelo final móstrase na táboa S1.
A menos que se especifique o contrario, os espectros de absorción UV/Vis/NIR foron recollidos nun espectrofotómetro Cary60 (Agilent, EUA) a intervalos de 1 nm de 250 nm a 1000 nm e un tempo de integración de 0,1 s.
Dilúa a mostra nunha cubeta de cuarzo cun percorrido de 2 mm ata A880 de 1 e recolla o espectro de absorción entre 400 e 1000 nm. Os espectros dicroicos circulares recolléronse nun espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Xapón) a intervalos de 1 nm entre 400 nm e 950 nm a unha velocidade de varrido de 20 nm min-1.
O coeficiente de extinción molar determínase diluíndo o complexo central a un A880 de aproximadamente 50. Dilúese o volume de 10 μl en 990 μl de tampón de unión ou metanol e recóllese o espectro de absorción inmediatamente para minimizar a degradación de BChl. O contido de BChl de cada mostra de metanol calculouse mediante o coeficiente de extinción a 771 nm de 54,8 mM-1 cm-1 e determinouse o coeficiente de extinción (51). Divida a concentración de BChl medida por 32 (RC-LH114-W) ou 36 (RC-LH116) para determinar a concentración do complexo central, que logo se usa para determinar o espectro de absorción da mesma mostra recollida no tampón. Coeficiente de extinción en paralelo. Tomáronse tres medicións repetidas para cada mostra e utilizouse para o cálculo a absorbancia media do máximo Qy de BChl. O coeficiente de extinción de RC-LH114-W medido a 878 nm é de 3280 ± 140 mM-1 cm-1, mentres que o coeficiente de extinción de RC-LH116 medido a 880 nm é de 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
A UQ10 cuantificouse segundo o método indicado en (52). En resumo, a HPLC de fase inversa (RP-HPLC) realizouse empregando o sistema HPLC Agilent 1200. Disolver aproximadamente 0,02 nmol de RC-LH116 ou RC-LH114-W en 50 μl de metanol:cloroformo ao 50:50 que contén cloruro férrico ao 0,02 % (p/v) e inxectar a Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm preequilibrada. Disolver en 1 ml⁻¹ min⁻¹ a 40 °C en disolvente HPLC (metanol:2-propanol ao 80:20) nunha columna de ×25 cm. Realizar unha elución isocrática nun disolvente HPLC para monitorizar a absorbancia a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoides) e 780 nm (BChl) durante 1 hora. Integrouse o pico no cromatograma de 275 nm aos 25,5 minutos, que non contiña ningún outro composto detectable. A área integrada utilízase para calcular a cantidade molar de UQ10 extraída con referencia á curva de calibración calculada a partir da inxección de estándares puros de 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Cada mostra analizouse en tres réplicas e o erro informado corresponde á desviación estándar da media.
Preparouse unha solución que contiña o complexo RC-LH1 cunha absorción máxima de Qy de 0,1 con 30 μM de citocromo c2 de corazón de cabalo reducido (Merck, Reino Unido) e de 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Reino Unido). Preparáronse tres mostras de 1 ml para cada concentración de UQ2 e incubáronse durante a noite na escuridade a 4 °C para garantir unha adaptación completa á escuridade antes da medición. A solución cargouse nun espectrofotómetro modular OLIS RSM1000 equipado cunha rede de chama de 300 nm/500 liñas, unha entrada de 1,24 mm, un centro de 0,12 mm e unhas fendas de saída de 0,6 mm. Colócase un filtro de paso longo de 600 nm na entrada do fototubo de mostra e do tubo fotomultiplicador de referencia para excluír a luz de excitación. A absorbancia monitorizouse a 550 nm cun tempo de integración de 0,15 s. A luz de excitación emítese desde o LED (díodo emisor de luz) M880F2 de 880 nm (Thorlabs Ltd., Reino Unido) a través dun cable de fibra óptica a unha intensidade do 90 % a través dun controlador DC2200 (Thorlabs Ltd., Reino Unido) e emítese á fonte de luz nun ángulo de 90°. O feixe de medición oponse ao espello para devolver calquera luz que non fose absorbida inicialmente pola mostra. Monitorízase a absorbancia 10 s antes da iluminancia de 50 s. Despois, monitorizouse a absorbancia durante 60 s na escuridade para avaliar ata que punto o quinolol reduce espontaneamente o citocromo c23+ (véxase a Figura S8 para os datos brutos).
Os datos procesáronse axustando unha taxa inicial lineal dentro de 0,5 a 10 s (dependendo da concentración de UQ2) e calculando a media das taxas das tres mostras para cada concentración de UQ2. A concentración de RC-LH1 calculada polo coeficiente de extinción respectivo utilizouse para converter a taxa na eficiencia catalítica, representada graficamente en Origin Pro 2019 (OriginLab, EUA) e axustada ao modelo de Michaelis-Menten para determinar os valores aparentes de Km e Kcat.
Para as medicións de absorción transitoria, a mostra RC-LH1 diluíuse a ~2 μM en tampón IMAC que contiña 50 mM de ascorbato de sodio (Merck, EUA) e 0,4 mM de terbutina (Merck, EUA). O ácido ascórbico utilízase como doante de electróns de sacrificio e o terc-butaclofeno utilízase como inhibidor de QB para garantir que o doante RC principal permaneza reducido (é dicir, non fotooxidado) durante todo o proceso de medición. Engádense aproximadamente 3 ml de mostra a unha cela rotatoria personalizada (duns 0,1 m de diámetro, 350 RPM) cunha lonxitude de percorrido óptico de 2 mm para garantir que a mostra na traxectoria do láser teña tempo suficiente para a adaptación á escuridade entre os pulsos de excitación. Utilízanse pulsos láser de ~100 fs para amplificar o sistema láser Ti: Sapphire (Spectra Physics, EUA) para excitar a mostra a 880 nm a unha taxa de repetición de 1 kHz (20 nJ para NIR ou 100 nJ para Vis). Antes de recoller datos, expoña a mostra á luz de excitación durante uns 30 minutos. A exposición provocará a inactivación da calidade de amplificación (posiblemente reducindo a calidade de amplificación unha ou dúas veces). Pero teña en conta que este proceso é reversible porque despois dun longo período de adaptación á escuridade, a RC volverá lentamente á actividade de calidade de amplificación. Utilizouse un espectrómetro Helios (Ultrafast Systems, EUA) para medir os espectros transitorios cun tempo de retardo de -10 a 7000 ps. Utilice o software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, EUA) para desagrupar os conxuntos de datos e, a continuación, fusionalos e estandarizalos. Utilice o paquete de software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) para usar o conxunto de datos combinado para obter espectros diferenciais relacionados co decaemento ou use unha función que convolva varios expoñentes coa resposta do instrumento para axustar a evolución espectral dunha soa lonxitude de onda en Origin (OriginLab, EUA).
Como se mencionou anteriormente (53), preparouse unha película fotosintética que contiña o complexo LH1 e que carecía tanto da antena RC como da antena LH2 periférica. A membrana diluíuse en 20 mM de tris (pH 8,0) e despois cargouse nunha cubeta de cuarzo cunha traxectoria óptica de 2 mm. Utilizouse un pulso láser de 30 nJ para excitar a mostra a 540 nm cun tempo de retardo de -10 a 7000 ps. Procesase o conxunto de datos como se describe para a mostra Rps.pal.
A membrana foi sedimentada por centrifugación a 150.000 RCF durante 2 horas a 4 °C e, a continuación, a súa absorbancia a 880 nm foi resuspendida en tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e NaCl 200 mM. Disolver a membrana axitando lentamente en β-DDM ao 2 % (p/v) durante 1 hora na escuridade a 4 °C. A mostra foi diluída en carbonato de trietilamonio 100 mM (pH 8,0) (TEAB; Merck, Reino Unido) ata unha concentración de proteína de 2,5 mg ml-1 (análise Bio-Rad). O procesamento posterior realizouse a partir do método publicado anteriormente (54), comezando coa dilución de 50 μg de proteína nun total de 50 μl de TEAB que contiña laurato de sodio ao 1 % (p/v) (Merck, Reino Unido). Tras a sonicación durante 60 segundos, reduciuse con 5 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (Merck, Reino Unido) a 37 °C durante 30 minutos. Para a S-alquilación, incubar a mostra con 10 mM de S-metiltiometanosulfonato de metilo (Merck, Reino Unido) e engadila dunha solución madre de isopropanol de 200 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente. A dixestión proteolítica levouse a cabo engadindo 2 μg dunha mestura de tripsina/endoproteinase Lys-C (Promega Reino Unido) e incubouse a 37 °C durante 3 horas. O surfactante laurato extraeuse engadindo 50 μl de acetato de etilo e 10 μl de ácido trifluoroacético de grao LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) ao 10 % (v/v) e axitando en vórtice durante 60 segundos. A separación de fases promoveuse mediante centrifugación a 15.700 RCF durante 5 minutos. Segundo o protocolo do fabricante, utilizouse unha columna de centrifugación C18 (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para aspirar e desalgar coidadosamente a fase inferior que contiña o péptido. Tras o secado mediante centrifugación ao baleiro, a mostra disolveuse en TFA ao 0,5 % e acetonitrilo ao 3 % e analizáronse 500 ng mediante cromatografía RP de nanofluxo acoplada a espectrometría de masas utilizando os parámetros do sistema detallados anteriormente.
Emprega MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para a identificación e cuantificación de proteínas para buscar a base de datos de proteomas de Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Os datos proteómicos de espectrometría de masas depositáronse na ProteomeXchange Alliance a través do repositorio de socios PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) co identificador de conxunto de datos PXD020402.
Para a análise por RPLC acoplada a espectrometría de masas por ionización por electropulverización, o complexo RC-LH1 preparouse a partir de Rps de tipo salvaxe. Usando o método publicado previamente (16), a concentración de proteína producida en células de *palustris* foi de 2 mg ml-1 en 20 mM de Hepes (pH 7,8), 100 mM de NaCl e 0,03 % (p/v) de β-(análise Bio-Rad)) DDM. Segundo o protocolo do fabricante, use un kit de purificación 2D (GE Healthcare, EUA) para extraer 10 μg de proteína mediante o método de precipitación e disolver o precipitado en 20 μl de ácido fórmico (FA) ao 60 % (v/v), acetonitrilo ao 20 % (v/v) e auga ao 20 % (v/v). Analizáronse cinco microlitros por RPLC (Dionex RSLC) acoplada a espectrometría de masas (Maxis UHR-TOF, Bruker). Empregar unha columna MabPac de 1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para a separación a 60 °C e 100 μlmin -1, cun gradiente do 85 % (v/v) de solvente A [0,1 % (v/v) de FA e 0,02 % (V/v) de solución acuosa de TFA] a un 85 % (v/v) de solvente B [0,1 % (v/v) de FA e 0,02 % (v/v) en acetonitrilo TFA ao 90 % (v/v)]. Usando unha fonte de ionización por electropulverización estándar e parámetros predeterminados durante máis de 60 minutos, o espectrómetro de masas obtén de 100 a 2750 m/z (relación masa-carga). Coa axuda da ferramenta FindPept do portal de recursos bioinformáticos ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapear o espectro de masas ás subunidades do complexo.
As células cultiváronse durante 72 horas baixo 100 ml de luz NF-baixa (10 μMm-2 s-1), media (30 μMm-2 s-1) ou alta (300 μMm-2 s-1). Medio M22 (medio M22 no que se omite o sulfato de amonio e se substitúe o succinato de sodio por acetato de sodio) nun frasco con tapón de rosca de 100 ml (23). En cinco ciclos de 30 segundos, colocáronse esferas de vidro de 0,1 micras nunha proporción de volume de 1:1 para lisar as células e arrefriáronse en xeo durante 5 minutos. A materia insoluble, as células non rotas e as esferas de vidro elimináronse por centrifugación a 16.000 RCF durante 10 minutos nunha microcentrífuga de mesa. A membrana separouse nun rotor de Ti 70.1 con 100.000 RCF en tris-HCl 20 mM (pH 8,0) cun gradiente de sacarosa ao 40/15 % (p/p) durante 10 horas.
Como se describiu no noso traballo anterior, inmunodetección da etiqueta His en PufW (16). En resumo, o complexo central purificado (11,8 nM) ou a membrana que contén a mesma concentración de RC (determinada por oxidación restando o espectro de diferenza reducido e coincidindo coa carga no xel tinguido) en tampón de carga 2x SDS (Merck, Reino Unido) diluído dúas veces. As proteínas separáronse nun xel NuPage de bis-tris ao 12 % réplica (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido). Un xel tinguiuse con azul brillante de Coomassie (Bio-Rad, Reino Unido) para cargar e visualizar a subunidade RC-L. A proteína do segundo xel transferiuse a unha membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) activada con metanol (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para inmunoensaio. A membrana de PVDF bloqueouse en tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, Tween-20 ao 0,2 % (v/v) e leite desnatado en po ao 5 % (p/v), e despois incubouse co anticorpo primario anti-His (en tampón de anticorpos diluído [tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM e Tween-20 ao 0,05 % (v/v)] en A190-114A 1:1000, Bethyl Laboratories, EUA) durante 4 horas. Despois de lavar 3 veces durante 5 minutos en tampón de anticorpos, a membrana combinouse cun anticorpo secundario anti-rato de peroxidase de ravo picante (Sigma-Aldrich, Reino Unido) (diluído 1:10.000 en tampón de anticorpos). Incubar para permitir a detección (5 minutos despois de 3 lavados en tampón de anticorpos) usando o substrato de quimioluminiscencia WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) e o Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Unido).
Debuxando a distribución de intensidade de cada xel tinguido ou carril de inmunoensaio, integrando a área baixo o pico e calculando a relación de intensidade de RC-L (xel tinguido) e Proteína-W (inmunoensaio), procesa a imaxe en ImageJ (57). Estas relacións convertéronse a relacións molares asumindo que a relación de RC-L a proteína-W na mostra pura de RC-LH114-W era de 1:1 e normalizando todo o conxunto de datos en consecuencia.
Para obter materiais complementarios para este artigo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Este é un artigo de acceso aberto distribuído segundo os termos da licenza Creative Commons Attribution. O artigo permite o uso, a distribución e a reprodución sen restricións en calquera medio coa condición de que a obra orixinal sexa citada correctamente.
Nota: Só che pedimos que facilites o teu enderezo de correo electrónico para que a persoa que recomendas á páxina saiba que queres que vexa o correo electrónico e que non é spam. Non capturaremos ningún enderezo de correo electrónico.
Esta pregunta úsase para comprobar se es visitante e evitar o envío automático de correo lixo.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
A estrutura de alta resolución do complexo da trampa de luz 1 no centro de reacción proporciona novos coñecementos sobre a dinámica da quinona.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
A estrutura de alta resolución do complexo da trampa de luz 1 no centro de reacción proporciona novos coñecementos sobre a dinámica da quinona.
©2021 Asociación Americana para o Avance da Ciencia. todos os dereitos reservados. AAAS é socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.